狂犬病ERA株G基因及其缺失片段表達(dá)載體的構(gòu)建和糖蛋白的表達(dá).pdf

1、狂犬病病毒糖蛋白至少有三種不同構(gòu)型：自然形式(N)、激活的水溶性狀態(tài)(A)和融合滅活構(gòu)型(l)。當(dāng)狂犬病病毒侵入宿主細(xì)胞時(shí)，糖蛋白調(diào)控使病毒囊膜與胞內(nèi)體膜發(fā)生融合。胞內(nèi)體內(nèi)低PH的條件可造成糖蛋白構(gòu)型的改變，并激活融合。當(dāng)PH為5.8-6.0時(shí)病毒可發(fā)生融合，而在PH 6.3以上就不能檢測(cè)到此現(xiàn)象。因此，確定狂犬病糖蛋白融合的功能域，了解融合的機(jī)制對(duì)狂犬病的控制就具有深遠(yuǎn)意義。 本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了GO/G10一對(duì)引物，用PCR分別

2、擴(kuò)增出狂犬病ERA株G基因及其4個(gè)缺失片段：G1G2、G3G4、G5G6、G7G8，將其分別克隆到pMD-18T載體上。用EcoR l/BstX l酶切pMD-G、pMD-一G1G2、pMD-G3G4、pMD-G5G6和pMD-G7G8，純化回收目的基因，亞克隆到真核表達(dá)載體plREsneo上，構(gòu)建了重組真核表達(dá)質(zhì)粒：p-G、p-G1G2、p-G3G4、p-G5G6和p-G7G8。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將純化的重組真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到倉(cāng)鼠腎細(xì)

3、胞(BHK-21)。經(jīng)G418篩選，獲得了表達(dá)糖蛋白的細(xì)胞克隆，將其挑出擴(kuò)大培養(yǎng)。穩(wěn)定傳代后抽提細(xì)胞總DNA，用GO/G10引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，擴(kuò)增出了相應(yīng)的G基因目的帶，用免疫熒光試驗(yàn)也檢測(cè)出了表達(dá)糖蛋白抗原，證明目的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞中，并且得到轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。而且在陽(yáng)性細(xì)胞凍存一個(gè)月后復(fù)蘇，細(xì)胞仍具有G418的抗性，并能檢測(cè)出目的蛋白，說(shuō)明了G基因在細(xì)胞的傳代及培養(yǎng)過(guò)程中不會(huì)丟失，且能穩(wěn)定表達(dá)，從而為進(jìn)一步研究狂犬病糖蛋白的融合性奠定