抗前列腺癌異種化PSCA融合抗原DNA疫苗實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[目的]選擇人前列腺干細(xì)胞抗原(prostate stem cell antigen，PSCA)作為治療靶點(diǎn)，以本實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)的pVAX1-neo-Fc-GPI-IRES-GM/B7 DNA疫苗載體為基礎(chǔ)，構(gòu)建用于治療前列腺癌的異種化PSCA融合抗原免疫增效DNA疫苗，評(píng)價(jià)以PSCA作為前列腺癌治療靶點(diǎn)的可行性，并為前列腺癌，特別是激素非依賴性前列腺癌的治療提供新策略。
　　 [方法](1)檢索GenBank，選擇包含人主要T

2、細(xì)胞抗原表位序列的人PSCA基因片段，應(yīng)用異種化抗原設(shè)計(jì)技術(shù)，保留人T細(xì)胞抗原表位，設(shè)計(jì)異種化PSCA融合抗原片段；(2)根據(jù)核酸序列按中心模板法設(shè)計(jì)引物，應(yīng)用重疊延伸PCR技術(shù)拼接合成異種化PSCA融合抗原片段基因，以PCR、限制性酶切和DNA序列測(cè)定法進(jìn)行鑒定；(3)利用DNA限制性內(nèi)切酶BssH II和Mlu I酶切后粘端互補(bǔ)的特點(diǎn)，采用同尾酶法構(gòu)建1-4拷貝異種化PSCA融合抗原片段(PSCA1-PSCA4)，并將上述片段分別插

3、入真核表達(dá)載體pCI-neo-Fc-GPI中，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，借助免疫熒光+流式細(xì)胞術(shù)考察插入片段表達(dá)效率，最終選定PSCA3片段進(jìn)行下一步研究；(4)將sig-PSCA3-Fc-GPI基因片段自pCI-PSCA3-Fe-GPI質(zhì)粒上切下，插入pVAX1-neo-IRES-GM/B7載體中，構(gòu)建免疫增效DNA疫苗pVAX1-PSCA3-FcGB，并應(yīng)用轉(zhuǎn)染Cos7細(xì)胞+免疫熒光/流式細(xì)胞術(shù)方法鑒定其在真核細(xì)胞中的表達(dá)情況；(5)給8周

4、齡雄性C57BL/6小鼠皮下種植RM-1細(xì)胞，制備小鼠前列腺癌模型，并采用股四頭肌肌肉注射+電脈沖法(Electroporation，EP)接種DNA疫苗質(zhì)粒pVAX1—PSCA3-FcGB，同時(shí)接種pVAX1空載體質(zhì)粒和pVAX1-PSCA1-FcGB質(zhì)粒作為對(duì)照，通過觀察計(jì)算免疫動(dòng)物的成瘤時(shí)間、腫瘤體積和抑瘤率，來(lái)評(píng)價(jià)該DNA疫苗在小鼠體內(nèi)的抑瘤效果。
　　 [結(jié)果](1)拼接合成了含有人主要T細(xì)胞表位的異種化PSCA融合抗

5、原片段基因，經(jīng)DNA測(cè)序證實(shí)與設(shè)計(jì)序列完全一致；(2)將異種化PSCA融合抗原片段進(jìn)行1—4拷貝串聯(lián)后，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞+免疫熒光/流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果證實(shí)PSCA3表達(dá)效率較高；(3)成功構(gòu)建了免疫增效DNA疫苗pVAX1-PSCA3-FcGB，并通過轉(zhuǎn)染Cos7細(xì)胞+免疫熒光/流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)證明該疫苗可以在真核細(xì)胞中有效表達(dá)；(4)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明抗前列腺癌免疫增效DNA疫苗pVAX1-PSCA3-FcGB能夠推遲RM-1細(xì)胞腫瘤的形成，但在