抗前列腺癌可復(fù)制型DNA疫苗pSCK-PSCA3的基礎(chǔ)研究.pdf

1、背景與目的：
　　 人前列腺干細胞抗原（prostate stem cell antigen，PSCA）高表達于進展期前列腺癌組織及前列腺癌轉(zhuǎn)移灶，與前列腺癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在前列腺癌診斷和治療研究中備受重視。本研究選擇人PSCA作為免疫治療的靶點，以塞姆利基森林病毒（Semliki Forest Virus，SFV）復(fù)制子載體pSCK為基礎(chǔ)，構(gòu)建用于治療前列腺癌的可復(fù)制型DNA疫苗pSCK-PSCA3，同時為評價疫苗的免疫

2、功能，在大腸桿菌BL21系統(tǒng)中表達和純化了人PSCA的融合蛋白，構(gòu)建了可以高效表達人PSCA的小鼠B16細胞系.本研究為pSCK-PSCA3疫苗的免疫功能評價奠定了堅實的實驗基礎(chǔ)，也為前列腺癌的免疫治療提供了一種全新策略。
　　 方法：
　　 （1）利用DNA重組技術(shù)將PSCA片段克隆入含有GST標簽的原核表達載體pET42a，雙酶切鑒定后得到正確的重組質(zhì)粒pET42a-PSCA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后，IPTG誘導(dǎo)表達

3、，用Glutathione Sepharose 4B柱對誘導(dǎo)蛋白進行純化，純化產(chǎn)物進行SDS-PAGE及Western Blot鑒定；
　　 （2）利用PCR擴增人PSCA全長基因的cDNA編碼區(qū)序列，插入到真核表達載體pcDNA3.1中，雙酶切及測序鑒定后得到正確的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-PSCA。利用脂質(zhì)體法將其轉(zhuǎn)染入小鼠黑色素瘤B16細胞，G418加壓篩選后得到陽性克隆。通過流式細胞術(shù)、免疫熒光及Western Blot

4、檢測PSCA在細胞系中的表達情況；
　　 （3）將sig-PSCA3-Fc-GPI-GM/B7基因片段自pVAX1-PSCA3-FcGB質(zhì)粒上切下，插入可復(fù)制型載體pSCK中，構(gòu)建可復(fù)制型DNA疫苗pSCK-PSCA3，并應(yīng)用流式細胞術(shù)及免疫組化鑒定其在真核細胞中的表達情況。
　　 結(jié)果：
　　 （1）pET42a-PSCA原核表達質(zhì)粒構(gòu)建正確，SDS-PAGE及Western Blot檢測顯示GST-PSCA融

5、合蛋白誘導(dǎo)表達成功，分子量大小約為43KD。
　　 （2）pcDNA3.1-PSCA真核表達質(zhì)粒構(gòu)建正確，建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人PSCA的B16細胞系，其表達率接近100％。
　　 （3）成功構(gòu)建了可復(fù)制型DNA疫苗pSCK-PSCA3，流式細胞術(shù)及免疫組化檢測證明該疫苗可以在真核細胞中有效表達。
　　 結(jié)論：
　　 在大腸桿菌BL21菌株中成功表達了PSCA融合蛋白，篩選出的B16細胞系可以高效表達PSCA基