腎癌G250-MN-CAIX抗原基因在釀酒酵母中的誘導(dǎo)表達(dá)及其意義.pdf

1、中山大學(xué)碩士學(xué)位論文腎癌G 2 5 0 ／M N ／C A I X 抗原基因在釀酒酵母中的誘導(dǎo)表達(dá)及其意義I n d u c i b l e E x p r e s s i n g a n d I d e n t i f i c a t i o n o f R e n a l C e l lC a r c i n o m aG 2 5 0 ／M N ／C A I X A n t i g e n G e n e i nS a c c h

2、a r o m y c e s c e r e v i s i a專 業(yè)申請人導(dǎo) 師答辯委員會主席：答辯委員會委員：外科學(xué)( 泌尿外科)劉 雷李曉飛教授中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院2 0 0 7 年5 月中國廣州中山太疊碩士學(xué)位論文。 G 2 5 0 ／_ ／C A I X 抗原基因在蠢稻葺坶中的誘導(dǎo)表達(dá)及其意義 - r 文■．毒酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，回收1 ．5 K b 的G 2 5 0c D N A 片段，并將G 2 5 0c D N

3、A片段定向克隆到釀酒酵母穿梭誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒p Y E S 2 ／N TC 中相應(yīng)的多克隆位點，連接產(chǎn)物經(jīng)菌落P C R 、雙酶切電泳及序列測定鑒定。2 重組質(zhì)粒p Y E S 2 ／N TC - G 2 5 0 轉(zhuǎn)化釀酒酵母：按I n v i t r o g e nS ．c ．E a s y c o m p “t r a n s f o r m a t i o n 試劑盒說明書制備釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞，加入1 - 3 u g 重組p Y E

4、 S 2 ／N T C - G 2 5 0 進(jìn)行轉(zhuǎn)化，尿嘧啶篩選出陽性轉(zhuǎn)化子并鑒定。3 p Y E S 2 ／N TC - G 2 5 0 在釀酒酵母中的誘導(dǎo)表達(dá)：將陽性克隆單菌落擴(kuò)增后接種于含2 9 6 半乳糖的S c - u r a 培養(yǎng)液，分別于誘導(dǎo)表達(dá)0 ，4 ，8 ，1 2 ，1 6 h 后收集酵母菌，抽提蛋白．4 表達(dá)產(chǎn)物的免疫印跡分析：取以上各時間點的樣品進(jìn)行S D SP A G E 電泳后，電轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜( N O

5、上，應(yīng)用抗G 2 5 0 特異性抗體進(jìn)行免疫印跡分析．結(jié)果1 p Y E S 2 ／N TC - 6 2 5 0 重組釀酒酵母誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：H i n d m 和X h o I 酶切鑒定結(jié)果顯示G 2 5 0c D N A 片段( 1 ．5 K b ) 已克隆入釀酒酵母誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒p Y E S 2 ／N Tc ，序列測定結(jié)果與已知序列同源性1 0 0 ％．2 釀酒酵母的p Y E S 2 ／N TC - G 2 5 0 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

6、及陽性轉(zhuǎn)化子的篩選：感受態(tài)釀酒酵母菌轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒后，經(jīng)尿嘧啶篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，菌落P C R及質(zhì)粒序列測定顯示轉(zhuǎn)化成功。3p Y E S 2 ／N T C - G 2 5 0 在釀酒酵母I N V S c l 中的誘導(dǎo)表達(dá)和W e s t e r n 印跡分析：攜重組質(zhì)粒p Y E S 2 ／N TC - 6 2 5 0 的宿主菌I N V S c l 進(jìn)行半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)，菌體裂解物應(yīng)用抗G 2 5 0 特異性抗體進(jìn)行W e s t e