耐甲氧西林金黃色葡萄球菌亞單位融合疫苗HI的免疫保護評價及其作用機制研究.pdf

1、目的:
　　金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是一種可寄生于宿主體表的條件致病菌,同時也是引起局部化膿性感染,肺炎,心內膜炎及全身膿毒血癥等醫(yī)院獲得性感染的主要致病菌。由于抗生素的濫用,出現(xiàn)耐受多種抗生素的新菌株,特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的迅速蔓延,使得單純依靠抗生素治療該病原菌引起的相關感染變得越來越困難。金黃色葡萄球菌疫苗的研究再次成為全球的熱點。
　　最近幾年,發(fā)展基于多價保護性的亞單位融

2、合疫苗是新型疫苗設計與研發(fā)的優(yōu)選研究策略。其最主要的目標是利用多價抗原靶向多個毒力因子,而這些毒力因子對病原菌的致病作用十分關鍵,因而多價抗原的策略更易研發(fā)出針對金黃色葡萄球菌的有效疫苗。
　　在宿主對抗金黃色葡萄球菌感染的過程中,體液免疫與細胞免疫都發(fā)揮著重要的作用。理想的抗金黃色葡萄球菌疫苗應該包含一些分泌性毒素抗原和細胞壁偶聯(lián)的相關抗原,而這些抗原能夠激發(fā)宿主產生保護性抗體以及誘導產生分泌IFN-γ和(或)IL-17的T細胞

3、,而IL-17對于中性粒細胞驅動與活化十分重要。
　　本研究的目的是構建基于IsdB與Hla為基礎的雙價融合疫苗,同時比較該雙價疫苗與單價的重組候選抗原在小鼠全身系統(tǒng)性MRSA感染動物模型中的免疫保護作用差異。進一步探究該基因工程雙價亞單位融合疫苗所產生的保護性抗體(調理抗體,中和抗體)及獲得性免疫細胞應答(IFN-γ,IL-17A)在免疫保護中的作用機制,為新型有效的基因工程多價亞單位融合疫苗的分子設計,抗原選擇及配伍優(yōu)化奠定堅

4、實的實驗基礎與理論指導。
　　方法:
　　1.從MRSA252中提取細菌基因組作為PCR的模板,通過重疊延伸PCR擴增目的基因HI,同時引入酶切位點BamHI與NotI。目的基因雙酶切后的回收產物與pGEX-6P-2表達載體相連,轉化到EscherichiacoliBL21菌株,在IPTG的誘導下表達GST融合蛋白,帶GST標簽的融合蛋白經PSP酶切初純,然后經CaptoTMMMC層析,過QHP去內毒素精細純化,最終的產物經

5、SDS-PAGE電泳進行分析。
　　2.通過尾靜脈注射MRSA252細菌,建立BALB/c小鼠全身感染的膿毒癥動物模型。BALB/c小鼠用重組蛋白加鋁佐劑免疫,并用PBS加鋁佐劑作為對照組。小鼠在末次免疫后,用MRSA252致死劑量1×109CFU感染小鼠,在感染后的14天里監(jiān)測小鼠的生存狀況。同時,用2.5×108CFU感染劑量感染小鼠,并對感染后臟器的細菌定植量與病理損傷進行檢測與分析。
　　3.為了評價重組蛋白疫苗主動

6、免疫后的體液免疫應答,用ELISA的方法檢測了針對不同重組蛋白抗原的特異性抗體,同時進行了抗體介導的調理吞噬作用實驗。為了評價重組蛋白疫苗的細胞免疫應答,檢測了免疫后脾細胞在重組蛋白體外刺激后的分泌的細胞因子水平(IFN-γ,IL-5,IL-17A),并進行了分泌細胞因子介導的殺傷作用實驗。為了評價免疫小鼠感染后腎臟細胞因子的水平,檢測了IFN-γ,IL-17A和CXCL2的水平。
　　結果:
　　1.構建表達載體質粒pGE

7、X-6P-2-HI,經IPTG誘導,重組蛋白以可溶形式進行表達并且其純化是高效的,SDS-PAGE分析其蛋白分子量與預期的一致。
　　2.建立了穩(wěn)定的BALB/c小鼠全身感染的膿毒癥動物模型。重組亞單位融合疫苗HI免疫后,用致死劑量攻毒,與對照組相比,其顯著提高了生存保護率(P=0.0002),與IH,IsdB,Hla,和鋁佐劑組,分別提高了6.7％,20%,26.7%和66.7%的保護率;用感染劑量攻毒,與對照組相比,重組蛋白(

8、HI,IH,IsdB,Hla)免疫后均能在一定程度上減少細菌在血液,脾臟,腎臟中的定植,同時減輕了病理的炎性損傷,而在所有組中,HI組的細菌定植量是最低的,同時腎臟的病理損傷也是最輕的。
　　3.重組亞單位融合疫苗HI免疫后產生了強的抗體應答,其中最高抗體效價為1:512000。產生的抗體針對其對應的亞單位IsdB與HlaH35L也有強的抗原抗體反應。重組抗原HI免疫小鼠后,體外刺激產生了脾細胞產生了較高IFN-γ,IL-5和IL

9、-17A細胞因子水平。HI誘導的免疫反應能夠增強體外抗體介導的調理吞噬作用與細胞因子介導的殺傷作用。HI免疫小鼠,在感染后腎臟中IFN-γ,IL-17A和CXCL2水平高于對照組,也高于IsdB和Hla組。
　　結論:
　　1.一種基于IsdB與Hla的亞單位融合疫苗HI成功的構建,表達。用該融合的雙價疫苗免疫后誘導機體產生了強的抗體與T細胞免疫應答。
　　2.該雙價亞單位融合疫苗產生的免疫保護強于其對應的亞單位產生的