靶向ftsZ基因反義肽肽核酸抑制耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分計(jì)算機(jī)輔助軟件設(shè)計(jì)聯(lián)合體外斑點(diǎn)雜交篩選靶向ftsZ基因反義寡核苷酸序列
　　目的:采用計(jì)算機(jī)輔助軟件設(shè)計(jì)聯(lián)合體外斑點(diǎn)雜交篩選能與耐甲氧西林金黃色葡萄球菌ftsZ基因mRNA緊密結(jié)合的高效反義寡核苷酸序列。
　　方法：利用計(jì)算機(jī)輔助軟件（RNA Structure5.0）對(duì)ftsZ mRNA進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析計(jì)算，并進(jìn)行自由能計(jì)算，在膨脹環(huán)，發(fā)卡等不穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)區(qū)域設(shè)計(jì)10條反義寡核苷酸序列，另設(shè)計(jì)一條與ftsZ基因上的一

2、段堿基序列完全相同的寡核苷酸序列作為陰性對(duì)照，合成反義探針，和體外轉(zhuǎn)錄并且用地高辛標(biāo)記的ftsZ mRNA進(jìn)行斑點(diǎn)雜交，根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)弱，篩選出高效的反義寡核苷酸序列。
　　結(jié)果：體外斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，計(jì)算機(jī)軟件設(shè)計(jì)的11條反義寡核苷酸序列中，其中有6條顯示不同程度的雜交信號(hào)，1條正義序列未顯示任何信號(hào)。
　　結(jié)論：計(jì)算機(jī)輔助軟件聯(lián)合體外斑點(diǎn)雜交能夠減少反義核酸設(shè)計(jì)的盲目性，為體外可靠、快速、高通量篩選高效反義寡核苷酸序列

3、提供了一種有效的方法，并且為篩選所有基因高效反義序列搭建了一個(gè)平臺(tái)。
　　第二部分靶向ftsZ基因反義肽肽核酸體外抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)
　　目的：研究以 fstZ基因?yàn)榘谢虻姆戳x肽核酸（peptide nucleic acid， PNA）對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（ methicillin-resistant Staphylococcus aureus， MRSA） fstZ基因表達(dá)的抑制作用和體外抗菌活性，探

4、討其作為新型抗菌藥物制潛在應(yīng)用價(jià)值。
　　方法：在本實(shí)驗(yàn)研究中，根據(jù)第一部分篩選出的能與 ftsZ基因高效緊密結(jié)合的反義寡核苷酸序列，合成肽核酸PNA1，同時(shí)，在ftsZ基因起始區(qū)域設(shè)計(jì)一條反義寡核苷酸序列，包括起始密碼子AUG和SD序列，合成肽核酸PNA2，在PNA1的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)一條有3個(gè)堿基錯(cuò)配的PNA1作為陰性對(duì)照，三條肽核酸分別與穿膜肽序列(RXR)4XB連接形成PPNA。分別用不同濃度的PPNA處理MRSA CY-11菌

5、株，37°C5％CO2培養(yǎng)不同時(shí)間后測(cè)定細(xì)菌光密度值OD600并每隔兩小時(shí)做平板菌落計(jì)數(shù)，觀察其對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)抑制作用，采用逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)ftsZ基因mRNA表達(dá)水平觀察其對(duì)靶基因表達(dá)的抑制作用。
　　結(jié)果：PPNA1，PPNA2均具有明顯的靶基因抑制作用和體外抗菌活性，并呈時(shí)間和濃度依賴性，其最低抑菌濃度分別為30μmol/L和40μmol/L，PPNA1在劑量為40μmol/L具有殺菌活性，而具有3個(gè)錯(cuò)配堿基的 Scr PPN