DNA-PKcs對鹽誘導(dǎo)激酶SIK2的調(diào)節(jié).pdf

1、敲低DNA-PKcs或抑制其激酶活性，研究DNA-PKcs對SIK2蛋白的穩(wěn)定性調(diào)節(jié)作用。體外純化SIK2蛋白，檢測DNA-PKcs對SIK2的磷酸化調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步明確DNA-PKcs磷酸化SIK2的位點(diǎn)及調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　敲低DNA-PKcs或抑制其激酶活性，首先觀察SIK2蛋白的變化；然后細(xì)胞經(jīng)放線菌酮CHX處理后，Western blot檢測DNA-PKcs對SIK2蛋白的半壽期影響。利用免疫共沉淀技術(shù)處理DNA-PKcs敲

2、低細(xì)胞（或抑制其激酶活性），檢測DNA-PKcs對SIK2蛋白泛素化降解的影響。構(gòu)建His標(biāo)簽的SIK2重組質(zhì)粒，導(dǎo)入BL21感受態(tài)細(xì)胞中原核誘導(dǎo)SIK2蛋白表達(dá)，并且進(jìn)行體外純化。建立體外磷酸化反應(yīng)體系，研究DNA-PKcs對SIK2的體外磷酸化調(diào)節(jié)作用，并通過質(zhì)譜分析檢測SIK2自磷酸化和磷酸化位點(diǎn)。用32P標(biāo)記DNA，EMSA電泳檢測SIK2能否結(jié)合DNA，并檢測DNA-PKcs對SIK2結(jié)合DNA是否有調(diào)節(jié)作用。
　　We

3、stern blot結(jié)果顯示，敲低或抑制 DNA-PKcs，SIK2的表達(dá)量下降;放線菌酮 CHX處理DNA-PKcs敲低細(xì)胞（或抑制其激酶活性），SIK2蛋白的半壽期縮短。免疫共沉淀結(jié)果顯示，敲低或抑制DNA-PKcs的激酶活性，SIK2蛋白的泛素化程度明顯增強(qiáng)。原核誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果顯示，成功構(gòu)建His標(biāo)簽SIK2重組質(zhì)粒，并在體外誘導(dǎo)表達(dá)，且純化出SIK2蛋白。體外磷酸化反應(yīng)結(jié)果顯示，SIK2可以發(fā)生自磷酸化，DNA-PKcs可以磷酸化

4、SIK2，且SIK2抑制DNA-PKcs的自磷酸化；質(zhì)譜分析確定SIK2的S358、S515、S534位點(diǎn)發(fā)生自磷酸化和DNA-PKcs在S512、S515、S534位點(diǎn)磷酸化SIK2。DNA Binding實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SIK2可以結(jié)合DNA，且DNA-PKcs可以增強(qiáng)SIK2對DNA的結(jié)合；DNA-PKcs也可以結(jié)合DNA，而SIK2卻抑制DNA-PKcs與 DNA的結(jié)合。
　　實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DNA-PKcs可以調(diào)節(jié)SIK2的穩(wěn)定性

5、，敲低或抑制其激酶活性，SIK2的表達(dá)量降低并且半壽期縮短，泛素化降解增強(qiáng)。SIK2可以自磷酸化，其自磷酸化位點(diǎn)為S358、S515、S534；DNA-PKcs可以磷酸化SIK2，其磷酸化位點(diǎn)為S512、S515、S534。DNA-PKcs可以發(fā)生磷酸化，且SIK2抑制其自磷酸化。SIK2可以結(jié)合DNA，并且DNA-PKcs能夠增強(qiáng)SIK2與DNA的結(jié)合。DNA-PKcs可以結(jié)合DNA，但是SIK2抑制DNA-PKcs與 DNA的結(jié)合。