HIV-1 Tat與DNA-PKcs相互作用及采用TALEN與CRISPR敲除細(xì)胞Tip60的研究.pdf

1、HIV-1 Tat蛋白是一個(gè)由HIV-1編碼的調(diào)控蛋白，對(duì)于HIV病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制具有至關(guān)重要的作用。Tat蛋白可以和宿主細(xì)胞內(nèi)多種蛋白發(fā)生相互作用促進(jìn)HIV病毒轉(zhuǎn)錄，并通過誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡破壞宿主免疫系統(tǒng)。此外，Tat可以作為一個(gè)旁分泌分子由受感染細(xì)胞分泌進(jìn)入未受感染細(xì)胞進(jìn)而增加其感染風(fēng)險(xiǎn)。DNA-PKcs是DNA依賴的蛋白激酶復(fù)合物DNA-PK的主要催化亞基，屬于磷脂酰肌醇3-激酶超家族(PI3K)，在DNA損傷后非同源末端修復(fù)過程

2、中發(fā)揮重要作用。DNA損傷發(fā)生后，DNA-PKcs通過Ku蛋白轉(zhuǎn)移到DNA損傷末端，從而被DNA末端激活啟動(dòng)DNA損傷修復(fù)反應(yīng)。不僅如此， DNA-PKcs在V(D)J重組、細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡與自吞噬過程中均發(fā)揮重要作用。
　　在此之前實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Tat能夠抑制DNA-PKcs的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)電離輻射的敏感度，并且能夠通過與Plk-1、Cyclin B、Tip60相互作用影響細(xì)胞周期變化。此外還證實(shí)HIV-1 Tat能夠直接結(jié)

3、合DNA-PKcs的核心啟動(dòng)子序列參與其表達(dá)下調(diào)，并首次將DNA-PKcs核心啟動(dòng)子區(qū)域由先前報(bào)道的-106～-3縮短至-63～-1。并發(fā)現(xiàn)HIV-1 Tat可以直接激活DNA-PKcs激酶活性，其活性水平與Tat蛋白成劑量依賴關(guān)系。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行了進(jìn)一步研究，取得的主要科研進(jìn)展有:
　　1.通過免疫共沉淀與GST-pull down實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證實(shí)了HIV-1 Tat可以直接與DNA-PKcs發(fā)生相互作用，同時(shí)無論內(nèi)源還是外源

4、Tat蛋白，都能夠明顯增強(qiáng)DNA-PKcs的S2056位點(diǎn)磷酸化水平。
　　2.既然DNA-PKcs作為類別轉(zhuǎn)換重組(CSR)的重要組成部分，為探索這一機(jī)制對(duì)Tat蛋白在CSR過程中的作用進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示低濃度（4μg/ml）的Tat蛋白能夠有效抑制類別轉(zhuǎn)換重組的發(fā)生，而高濃度（8μg/ml）時(shí)則會(huì)刺激CSR的發(fā)生。
　　3.既然Tat可以與DNA-PKcs相互作用并調(diào)控其活性，那么DNA-PKcs是否也可以通過Tat參

5、與調(diào)控HIV-1轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示低水平且具有活性的DNA-PKcs對(duì)于HIV-1的轉(zhuǎn)錄是必不可少的，而DNA-PKcs在高表達(dá)水平且激酶活性較低時(shí)則能夠明顯抑制HIV-1的轉(zhuǎn)錄。
　　4.免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)表明DNA-PKcs雖能夠與cyclin T1、CDK9、Tat形成一個(gè)巨大的復(fù)合體，但DNA-PKcs僅僅與CDK9和Tat蛋白直接結(jié)合而與cyclin T1并無直接相互作用。
　　研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于未來DNA-PKcs的研究提

6、供了一個(gè)新的方向，對(duì)Tat蛋白在宿主體液免疫中作用的研究提供了新的思路與理論意義。同時(shí)提出了一種的可能性，即是否可以通過對(duì)DNA-PKcs的直接抑制和干預(yù)抑制艾滋病患者體內(nèi)HIV-1的轉(zhuǎn)錄，這對(duì)未來抗HIV治療及其新藥的研制提供了新的策略。
　　Tip60(Tat interactive protein，60kD)最早是通過酵母雙雜交的方法所鑒定出來的可以與HIV1-tat相互作用的蛋白，由于其分子量為60kd，故被命名為Tip6

7、0。Tip60屬于MYST乙?；D(zhuǎn)移酶家族，主要參與乙?；M蛋白H2A、H3、H4及多種相關(guān)蛋白，調(diào)控相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄及下游分子應(yīng)答。大量文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道Tip60可以作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與核受體及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合進(jìn)一步激活或者抑制下游基因的表達(dá)，如雄激素受體、AICD/Fe65、NCoR、c-MYC、E2F等，此外Tip60還可以通過乙?；幌盗械鞍渍{(diào)控其活性與穩(wěn)定性。當(dāng)DNA雙鏈發(fā)生斷裂損傷后，Tip60可以通過乙?；疉TM的K3016位點(diǎn)促進(jìn)AT

8、M發(fā)生自磷酸化進(jìn)而激活下游底物P53、chk2，誘導(dǎo)DNA損傷修復(fù)反應(yīng)。綜上所述，可以看到Tip60在基因轉(zhuǎn)錄、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期檢查點(diǎn)、凋亡與自吞噬等方面均發(fā)揮重要調(diào)控作用。此外，Tip60還可以影響腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，它的失活將會(huì)導(dǎo)致DNA損傷修復(fù)缺陷及癌癥風(fēng)險(xiǎn)的增加。
　　由于Tip60基因雙位點(diǎn)敲除小鼠會(huì)導(dǎo)致胚胎致死，分別采用了當(dāng)前最先進(jìn)的TALEN與CRISPR兩種基因敲除技術(shù)在細(xì)胞水平穩(wěn)定敲除內(nèi)源性T

9、ip60基因，建立能夠穩(wěn)定敲除Tip60基因的細(xì)胞系，為后續(xù)研究Tip60在DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控、自吞噬調(diào)控中的作用打下基礎(chǔ)。
　　TALEN技術(shù)實(shí)驗(yàn)流程:
　　首先根據(jù)Tip60基因序列并結(jié)合生物信息學(xué)設(shè)計(jì)多個(gè)靶位點(diǎn)識(shí)別序列;分別根據(jù)識(shí)別序列進(jìn)行TALEN質(zhì)粒對(duì)的構(gòu)建工作;成功構(gòu)建并測(cè)序驗(yàn)證后提取質(zhì)粒;直接采用提取的TALEN質(zhì)粒對(duì)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，并于轉(zhuǎn)染48h后提取多克隆細(xì)胞基因組;采用對(duì)應(yīng)引物PCR擴(kuò)增含

10、有切割位點(diǎn)的基因序列，并于回收后進(jìn)行退火處理，最后采用T7核酸內(nèi)切酶酶切檢測(cè)靶位點(diǎn)是否發(fā)生變化進(jìn)而對(duì)TALEN切割效率進(jìn)行檢測(cè)。
　　接下來選擇具有較高切割效率的TALEN質(zhì)粒對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞;并于48h后將細(xì)胞稀釋至96孔板培養(yǎng)，使每孔理論上只有一個(gè)細(xì)胞;當(dāng)培養(yǎng)約4～5周左右待細(xì)胞長(zhǎng)滿后傳至12孔板繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng);待其再次長(zhǎng)滿后取部分細(xì)胞提取單克隆細(xì)胞基因組;采用PCR技術(shù)擴(kuò)增靶片段，并將單克隆細(xì)胞基因組PCR回收產(chǎn)物與野生型細(xì)胞基因組

11、PCR回收產(chǎn)物混合后退火處理;采用T7內(nèi)切酶酶切鑒定篩選陽(yáng)性單克隆;選擇陽(yáng)性片段克隆到T載體，測(cè)序篩選移碼突變細(xì)胞系，篩選Tip60基因穩(wěn)定敲除的細(xì)胞系。
　　CRISPR技術(shù)實(shí)驗(yàn)流程:
　　CRISPR技術(shù)同樣根據(jù)Tip60基因序列并結(jié)合生物信息學(xué)設(shè)計(jì)多個(gè)靶位點(diǎn)識(shí)別序列并根據(jù)設(shè)計(jì)的靶位點(diǎn)進(jìn)行CRISPR識(shí)別序列的構(gòu)建;待識(shí)別序列構(gòu)建好并測(cè)序驗(yàn)證成功后通過慢病毒包裝系統(tǒng)包裝為慢病毒;將包裝好的CRISPR慢病毒感染U2OS細(xì)

12、胞，感染48h后使用嘌呤霉素對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，將篩選過的細(xì)胞再次感染Cas9腺病毒后提取細(xì)胞基因組;采用對(duì)應(yīng)引物PCR擴(kuò)增含有切割位點(diǎn)的基因序列并退火處理，最后采用T7核酸內(nèi)切酶酶切檢測(cè)CRISPR切割效率與活性。
　　選擇具有較高切割效率的CRISPR慢病毒感染細(xì)胞48小時(shí)并用puro處理一周后感染腺病毒;將存活細(xì)胞稀釋至96孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，使每孔理論上只有一個(gè)細(xì)胞;之后篩選工作與TALEN技術(shù)相同，采用T7內(nèi)切酶酶切鑒定篩選出穩(wěn)