沙門(mén)氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白SseF與宿主細(xì)胞TIP60相互作用機(jī)制的研究.pdf

1、沙門(mén)氏菌是一種兼性胞內(nèi)菌,它能夠在細(xì)胞內(nèi)一種膜性結(jié)構(gòu)中存活和繁殖,這種膜性結(jié)構(gòu)稱(chēng)為包裹沙門(mén)氏菌的液泡(salmonella containing vacuoles,SCV),SCV膜的完整性及在細(xì)胞中的遷移與沙門(mén)氏菌的致病機(jī)理密切相關(guān)。細(xì)胞內(nèi)的沙門(mén)氏菌通過(guò)一種蛋白分泌系統(tǒng),稱(chēng)之為Ⅲ型分泌系統(tǒng)(type Ⅲ secretion isystem,TTSS),分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)一批效應(yīng)蛋白,在細(xì)菌與宿主相互作用的過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。在感染細(xì)胞后所分

2、泌的效應(yīng)蛋白中,SifA,SseF和SseG對(duì)于維持SCV膜的完整性及在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸和定位過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。已有的研究表明SifA通過(guò)調(diào)控液泡膜募集驅(qū)動(dòng)蛋白進(jìn)而調(diào)控SCV的定向遷移,但是對(duì)于SseF的作用機(jī)制尚不清楚,因此本課題設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)尋找與SseF相互作用的宿主細(xì)胞蛋白,并進(jìn)一步分析其機(jī)制。
　　為了尋找宿主細(xì)胞中SseF的靶蛋白,首先構(gòu)建SseF的全長(zhǎng)釣餌表達(dá)質(zhì)粒,利用酵母雙雜交實(shí)驗(yàn),通過(guò)順序轉(zhuǎn)化的方式轉(zhuǎn)化酵母菌AH1

3、09,篩選人腎cDNA文庫(kù),沒(méi)有找到相互作用蛋白,分析原因可能由于SseF蛋白結(jié)構(gòu)中含有三個(gè)高度疏水的跨膜結(jié)構(gòu)影響了其在酵母細(xì)胞中的定位,從而影響雙雜交結(jié)果,因此構(gòu)建了SseF的截短突變體釣餌表達(dá)質(zhì)粒再次篩選人腎cDNA文庫(kù),發(fā)現(xiàn)SseF能夠與宿主細(xì)胞乙酰基轉(zhuǎn)移酶TIP60特異性相互作用,這種相互作用進(jìn)一步經(jīng)pull-down實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。為了確定SseF與TIP60相互作用的功能域,構(gòu)建了一系列SseF的截短突變體,經(jīng)酵母雙雜交及pull

4、-down實(shí)驗(yàn)表明SseF50-66足以和TIP60相互作用。
　　為了探討SseF和TIP60相互作用的分子機(jī)制,首先驗(yàn)證SseF是否作為T(mén)IP60的底物,構(gòu)建了SseF和TIP60的原核表達(dá)質(zhì)粒,利用組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶實(shí)驗(yàn)(histone acetyltranseferse assay,HAT assay)發(fā)現(xiàn)SseF能被TIP60乙?；揎?。組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶活性缺失突變的TIP60不能使SseF乙?；揎?。進(jìn)一步做點(diǎn)突變分

5、析表明SseF第25位的賴(lài)氨酸是TIP60發(fā)生乙?；揎椀奶禺愋晕稽c(diǎn)。
　　為了探討SseF的乙?；瘜?duì)其功能的影響,首先利用同源重組方法構(gòu)建了沙門(mén)氏菌染色體.sseF全長(zhǎng)缺失突變株和潛在乙?；稽c(diǎn)點(diǎn)突變株,分別使用個(gè)突變株和野生株感染巨噬細(xì)胞,利用慶大霉素保護(hù)實(shí)驗(yàn)計(jì)算感染12小時(shí)后細(xì)菌在巨噬細(xì)胞中的增殖率,結(jié)果顯示,在染色體突變sseF潛在乙酰化位點(diǎn)后,發(fā)現(xiàn)沙門(mén)氏菌在巨噬細(xì)胞中的增殖率較野生株相比降低了約50％,此點(diǎn)突變株的表型與

6、sseF全長(zhǎng)缺失突變株表型類(lèi)似。這些數(shù)據(jù)提示SseF的乙?；揎椗c其功能的發(fā)揮密切相關(guān):進(jìn)一步利用RNA干擾技術(shù)降低宿主細(xì)胞TIP60的表達(dá)并觀(guān)察對(duì)沙門(mén)氏菌感染細(xì)胞后相關(guān)表型的影響,構(gòu)建了siRNATIP60干擾載體,并通過(guò)蛋白免疫印跡技術(shù)和免疫熒光確定了siRNATIP60干擾載體的感染效率。沙門(mén)氏菌分別感染干擾載體處理的Hela細(xì)胞和巨噬細(xì)胞并觀(guān)察宿主細(xì)胞TIP60的表達(dá)對(duì)沙門(mén)氏菌感染相關(guān)表型的影響。結(jié)果顯示,降低宿主細(xì)胞中TIP6

7、0的表達(dá)后,沙門(mén)氏菌感染的Hela細(xì)胞內(nèi)觀(guān)察不到Sifs的形成,并且沙門(mén)氏菌在巨噬細(xì)胞中的增殖率顯著降低。這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明沙門(mén)氏菌感染宿主細(xì)胞后,其分泌的效應(yīng)蛋白SseF通過(guò)與宿主細(xì)胞乙酰基轉(zhuǎn)移酶TIP60特異性相互作用并被乙?；揎?并且SseF的乙酰化修飾與其功能的發(fā)揮密切相關(guān)。
　　綜上所述,本研究首次發(fā)現(xiàn)沙門(mén)氏菌感染宿主細(xì)胞后,其分泌的效應(yīng)蛋白SseF能夠與宿主細(xì)胞的組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶TIP60特異性相互作用并且被乙酰化修