雙鏈DNA誘導(dǎo)細(xì)胞STING蛋白降解及調(diào)節(jié)機(jī)制研究.pdf

1、干擾素基因刺激蛋白（Stimulator of interferon gene，STING）是雙鏈DNA(double-stranded DNA，dsDNA)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生天然免疫反應(yīng)的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，在dsDNA的刺激下，STING可介導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生Ⅰ型干擾素(Interferon，IFN)、白介素6(Interleukin6，IL-6)及IL-1β等細(xì)胞因子，從而使細(xì)胞發(fā)揮抗病毒、抗細(xì)菌的作用。作為重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，STING蛋白水平

2、的高低直接影響天然免疫反應(yīng)強(qiáng)度，研究STING蛋白水平調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)于有效調(diào)節(jié)天然免疫反應(yīng)強(qiáng)度具有重要意義。以往研究發(fā)現(xiàn)，多種細(xì)胞分子機(jī)制可通過(guò)泛素化蛋白酶體降解方式調(diào)節(jié)STING蛋白水平，進(jìn)而影響其介導(dǎo)天然免疫反應(yīng)的強(qiáng)度。在此基礎(chǔ)上，我們?cè)噲D進(jìn)一步研究STING蛋白的調(diào)節(jié)機(jī)制，該工作也可為進(jìn)一步豐富DNA天然免疫信號(hào)通路提供數(shù)據(jù)。
　　在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染可誘導(dǎo)MRC-5細(xì)胞中STING蛋白表達(dá)水平降低，表現(xiàn)出明顯的時(shí)

3、間效應(yīng)和劑量效應(yīng)。另外，除了質(zhì)粒DNA以外，其他dsDNA，如PCR擴(kuò)增的dsDNA片段、人基因組DNA、不同的病毒基因組DNA都可誘導(dǎo)STING蛋白水平的降低，說(shuō)明STING蛋白水平下降是dsDNA轉(zhuǎn)染的一個(gè)普遍現(xiàn)象。不同長(zhǎng)度DNA片段檢測(cè)結(jié)果顯示，短于1000bp的DNA片段不能誘導(dǎo)STING蛋白水平的降低。
　　為研究STING蛋白降解的生物學(xué)效應(yīng)，我們對(duì)STING蛋白與維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ(Retinoic acid indu

4、cible geneⅠ，RIG-Ⅰ)、IL-6以及IFN-β之間的關(guān)系進(jìn)行研究。首先，研究下調(diào)STING蛋白水平對(duì)這三個(gè)分子表達(dá)水平的影響。利用STING特異性的siRNA(siSTING)下調(diào)STING蛋白水平可顯著降低RIG-Ⅰ的表達(dá)，首次發(fā)現(xiàn)RIG-Ⅰ除了可作為RNA或DNA感受器外，還可作為STING蛋白激活的下游分子。與已有研究結(jié)果相同，下調(diào)STING蛋白水平可降低IL-6和IFN-β的表達(dá)，以上研究表明這三個(gè)分子都是STIN

5、G激活的下游分子。其次研究RIG-Ⅰ、IL-6和IFN-β是否參與調(diào)節(jié)STING蛋白的降解，結(jié)果發(fā)現(xiàn):1）利用RIG-Ⅰ特異性的siRNA(siRIG-Ⅰ)下調(diào)RIG-Ⅰ表達(dá)，可部分提高STING蛋白水平，首次發(fā)現(xiàn)RIG-Ⅰ可反向誘導(dǎo)STING蛋白的降解;2）利用IL-6抗體處理細(xì)胞，阻斷IL-6的功能，可使STING蛋白水平略有上升，提示IL-6也在一定程度上參與STING蛋白的降解;3）外源加入IFN-β不能降低STING蛋白水平，

6、提示IFN-β本身可能不參與調(diào)節(jié)STING蛋白的降解。最后研究RIG-Ⅰ、IL-6和IFN-β之間以及與STING蛋白的相互關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)外源加入IFN-β可顯著提高RIG-Ⅰ的表達(dá)，提示RIG-Ⅰ和IFN-β是同一信號(hào)通路上的兩個(gè)分子，RIG-Ⅰ是IFN-β激活的下游分子。單獨(dú)加入IFN-β可誘導(dǎo)RIG-Ⅰ表達(dá)，但不能誘導(dǎo)STING蛋白的降解，說(shuō)明RIG-Ⅰ單個(gè)分子不能啟動(dòng)STING蛋白的降解。同時(shí)，siRIG-Ⅰ與IL-6抗體共同作

7、用可進(jìn)一步抑制STING蛋白的降解，提示RIG-Ⅰ與IL-6在誘導(dǎo)STING蛋白降解效應(yīng)上具有協(xié)同作用，也同樣說(shuō)明STING蛋白的降解需要多個(gè)分子共同作用?？傊?，STING的激活可以明顯增強(qiáng)RIG-Ⅰ、IL-6和IFN-β的產(chǎn)生，而持續(xù)的RIG-Ⅰ、IL-6以及IFN-β增高又會(huì)誘導(dǎo)STING蛋白的降解，說(shuō)明這是宿主細(xì)胞為了避免過(guò)強(qiáng)免疫反應(yīng)所采取的一種負(fù)反饋調(diào)控機(jī)制。
　　為研究STING蛋白的降解機(jī)制，利用蛋白酶體抑制劑Bort

8、ezomib共處理質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞并利用免疫共沉淀法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，STING蛋白的降解依賴于泛素化-蛋白酶體途徑。然而，特異性下調(diào)泛素化E3連接酶RNF5的表達(dá)，不能抑制STING蛋白的降解，排除了RNF5作為STING蛋白降解的泛素化E3連接酶的可能。在泛素化位點(diǎn)研究上，誘導(dǎo)突變STING蛋白上所有的賴氨酸殘基均不能抑制STING蛋白的降解，說(shuō)明STING蛋白的降解可能發(fā)生了非常規(guī)的泛素化修飾。另外，特異性下調(diào)干擾素刺激基因(Interfer

9、on stimulated genes，ISG) ISG15蛋白水平，可進(jìn)一步促進(jìn)STING蛋白的降解，提示蛋白降解同時(shí)受到泛素化和ISG化兩種修飾的反向調(diào)節(jié)。
　　為驗(yàn)證其他細(xì)胞是否也存在STING蛋白降解的負(fù)反饋調(diào)控機(jī)制，對(duì)人二倍體細(xì)胞（2BS和KMB17）、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞及部分腫瘤細(xì)胞或永生化細(xì)胞系（NCI-H358、Hela、HEK293、NCI-H1703和BEAS）進(jìn)行檢測(cè)，在質(zhì)粒DNA的刺激下，除HEK293、NC