USP19在DNA雙鏈損傷應(yīng)答中的功能及機(jī)制研究.pdf

1、細(xì)胞周期的正常運(yùn)行，尤其是有絲分裂期的一系列復(fù)雜而精細(xì)事件的調(diào)控，是保證基因組穩(wěn)定性的關(guān)鍵[1]。遺傳物質(zhì)經(jīng)過(guò)復(fù)制和有絲分裂期的染色體的正確分離，平均地分給子代細(xì)胞。當(dāng)DNA發(fā)生損傷，正常細(xì)胞可以激活相應(yīng)的周期檢查點(diǎn)，延緩或阻滯有絲分裂進(jìn)程并啟動(dòng)修復(fù)，待修復(fù)正確完成才繼續(xù)分裂[2，3];如果檢查點(diǎn)失去正常功能或修復(fù)機(jī)制缺陷，受損遺傳物質(zhì)帶著錯(cuò)誤進(jìn)入有絲分裂，傳到子代細(xì)胞，就引入了突變，突變隨著有絲分裂而累積，從而引起基因組不穩(wěn)定，最終導(dǎo)

2、致腫瘤的發(fā)生[4-7]。
　　DNA雙鏈斷裂是最嚴(yán)重的一種DNA損傷，如果不得到修復(fù)，細(xì)胞將面臨染色體斷裂和死亡，不正確的修復(fù)又可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[8]。細(xì)胞為了應(yīng)對(duì)雙鏈斷裂，主要有兩條修復(fù)途徑:同源重組和非同源末端連接，共同維持細(xì)胞的基因組穩(wěn)定[1，9-12]。DNA損傷是腫瘤治療的常用手段，因此，DNA修復(fù)在腫瘤治療中至關(guān)重要。DNA修復(fù)缺陷會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)DNA損傷高度敏感[13]，但當(dāng)DNA修復(fù)能力異常增強(qiáng)，則導(dǎo)致腫瘤耐受DN

3、A損傷刺激，即產(chǎn)生耐藥[14，15]。同時(shí)，DNA修復(fù)缺陷的生物個(gè)體經(jīng)常有各種遺傳病癥，通常隨著年齡的增長(zhǎng)有極高的罹患癌癥的幾率。因此，以DNA修復(fù)作為靶點(diǎn)，是腫瘤臨床輔助治療的重要思路[16]。
　　本項(xiàng)工作利用siRNA基因沉默高通量篩選平臺(tái)，結(jié)合Time-lapse活細(xì)胞實(shí)時(shí)成像技術(shù)，篩選調(diào)控有絲分裂的新功能蛋白。篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)USP19參與調(diào)控細(xì)胞有絲分裂，敲低USP19表達(dá)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞在有絲分裂后期出現(xiàn)染色體錯(cuò)誤分離(ch

4、romosomemis-segregation)的比率升高，形成“染色體橋”和“微核”，提示細(xì)胞的DNA損傷應(yīng)答及修復(fù)機(jī)制失常。同時(shí)，持續(xù)增加的染色體錯(cuò)誤分離比率是導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定性和腫瘤發(fā)生的重要因素之一[17，18]。
　　USP19是泛素特異性加工酶（ubiquitin-specific processing enzymes，UBPs或USPs），屬于去泛素化酶的一員，在組織中廣泛表達(dá)。USP19能水解底物蛋白上的泛素鏈的鏈

5、接，起到去泛素化的作用。USP19在缺氧、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、肌肉萎縮、細(xì)胞增殖中發(fā)揮一定作用[19-21]，目前對(duì)USP19沒(méi)有關(guān)于DNA損傷及修復(fù)方面的任何報(bào)道，但是磷酸化蛋白質(zhì)組的大規(guī)模篩選鑒定到USP19有DNA損傷相關(guān)的磷酸化位點(diǎn)，因此，深入研究USP19參與DNA損傷應(yīng)答及修復(fù)的功能及分子機(jī)制有其重要意義。
　　在此基礎(chǔ)上，為了確證USP19蛋白質(zhì)在維持染色體穩(wěn)定性中的作用，展開(kāi)了初步探索，研究結(jié)果如下:
　　(1)在蛋

6、白水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)USP19受電離輻射誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)，表明USP19可能在DNA損傷反應(yīng)中發(fā)揮一定的功能。
　　(2)為了驗(yàn)證USP19是否能被ATM/ATR磷酸化[22]，外源轉(zhuǎn)染Flag-USP19后，用Flag beads富集UV或IR處理前后的Flag-USP19，以特異性識(shí)別phospho-SQ/TQ的抗體孵育，發(fā)現(xiàn)在UV或IR輻射處理后USP19確實(shí)被磷酸化，而且它的磷酸化會(huì)被PIKK抑制劑wortmannin抑制，說(shuō)明US

7、P19的激酶屬于PIKK激酶。
　　(3)敲低USP19的蛋白表達(dá)，檢測(cè)IR輻射后DNA損傷應(yīng)答相關(guān)蛋白的水平，發(fā)現(xiàn)多個(gè)損傷反應(yīng)蛋白的磷酸化水平降低，包括p-Chk1(Ser317)，p-Chk2(Thr68)，p-KAP1(Ser824)及γ-H2AX，輻射后檢查點(diǎn)導(dǎo)致的G2/M阻滯也有延后，這些結(jié)果表明USP19對(duì)DNA損傷應(yīng)答具有重要作用;
　　(4)HR和NHEJ修復(fù)報(bào)告系統(tǒng)提示，敲低USP19表達(dá)后HR和NHEJ修

8、復(fù)能力都有上調(diào)，尤其是NHEJ修復(fù)途徑，提示USP19參與調(diào)控雙鏈斷裂的修復(fù)。“染色體橋”的成因就是染色體末端通過(guò)NHEJ途徑融合，敲低的USP19“染色體橋”增多，和敲低后NHEJ途徑增強(qiáng)，是具有一致性的。同時(shí)，敲低USP19后細(xì)胞DNA修復(fù)能力變強(qiáng)可能與腫瘤細(xì)胞耐藥的機(jī)制有關(guān);
　　(5)細(xì)胞內(nèi)源相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)提示USP19與HDAC1和HDAC2可能存在于一個(gè)功能復(fù)合體內(nèi)[23]，通過(guò)co-IP，我們驗(yàn)證了USP19與HDA

9、C1和HDAC2確實(shí)存在相互作用。已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道HDAC1和HDAC2能促進(jìn)DNA雙鏈斷裂修復(fù)，尤其是非同源末端連接，這提示USP19可能部分通過(guò)HDAC1和HDAC2發(fā)揮其在DNA修復(fù)方面的功能;
　　(6)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)USP19在卵巢癌和頭頸癌中存在缺失，提示USP19對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。
　　綜上所述，我們對(duì)USP19參與調(diào)節(jié)DNA損傷及修復(fù)的機(jī)制進(jìn)行了推想，一方面USP19可能通過(guò)調(diào)控DDR相關(guān)蛋白的修飾而