miRNA-146a在人正常軟骨細(xì)胞壓力損傷模型中的功能及機制研究.pdf

1、miRNA-146a是最早發(fā)現(xiàn)的與骨性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的差異性 miRNA。我們通過miRNA芯片技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)其在急性壓力損傷后的軟骨細(xì)胞中表達也會上調(diào)。然而miRNA-146a在軟骨細(xì)胞壓力損傷中的作用尚不清楚。本研究的目的就是希望找到miRNA-146a的靶基因,并闡明其在軟骨細(xì)胞壓力損傷中的作用機制。
　　miRNA芯片技術(shù)研究顯示,相對于正常軟骨細(xì)胞,壓力損傷后的軟骨細(xì)胞miRNA-146a表達上調(diào),采用關(guān)聯(lián)分析的方法,發(fā)現(xiàn)生物

2、信息學(xué)分析預(yù)測的miRNA-146a的靶基因SMAD4,在聯(lián)合應(yīng)用的全基因組基因芯片結(jié)果中低表達。因此,我們推測miRNA-146a通過SMAD4介導(dǎo)的方式來調(diào)控軟骨細(xì)胞的壓力損傷。
　　研究目的:
　　在這一假設(shè)的基礎(chǔ)上,本實驗擬通過研究闡明 miRNA-146a在軟骨細(xì)胞壓力損傷中的調(diào)控作用及其分子機制;證明SMAD4是miRNA-146a的直接靶基因,并參與介導(dǎo) miRNA-146a對軟骨細(xì)胞壓力損傷的調(diào)控。我們希望此

3、研究可以為臨床上急性關(guān)節(jié)損傷的治療帶來新的研究思路和切入點。
　　研究方法:
　　1.原代分離及培養(yǎng)人軟骨細(xì)胞和骨性關(guān)節(jié)炎細(xì)胞,使用光鏡下觀察其生長情況,MTT法繪制生長曲線,采用甲苯胺藍染色、II型膠原免疫組化染色等方法對比兩種細(xì)胞的差別。
　　2.研制一套具有自主知識產(chǎn)權(quán)的實用多功能細(xì)胞壓力加載系統(tǒng),為進行細(xì)胞力學(xué)相關(guān)實驗奠定基礎(chǔ)。使用該系統(tǒng)構(gòu)建軟骨細(xì)胞壓力損傷模型,力求盡量模擬高能損傷的力學(xué)特點。
　　3.

4、聯(lián)合應(yīng)用miRNA芯片和全基因組基因芯片篩選正常及壓力損傷后軟骨細(xì)胞的差異miRNA和基因。采用Realtime RT-PCR分析的方法,驗證壓力損傷組特異性高表達的miRNA-146a表達情況是否與芯片結(jié)果一致,采用Realtime RT-PCR的方法及Western Blot的方法,驗證芯片結(jié)果中SMAD4和VEGF的差異表達。
　　4.通過向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miRNA-146a的模擬物、抑制物、無關(guān)序列和空白對照組的方式,調(diào)控mi

5、RNA-146a的表達,進一步研究其功能。
　　5.觀察調(diào)控miRNA-146a的表達后,對軟骨細(xì)胞生物學(xué)特性的影響,并使用實時定量RT-PCR和Western-blot檢測各組中SMAD4和VEGF的表達情況。
　　6.觀察miRNA-146a的上調(diào)和下調(diào)后對軟骨細(xì)胞壓力損傷作用的影響
　　7.采用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)證明SMAD4的mRNA3’UTR和miRNA-146a之間可以直接結(jié)合,驗證了SMAD4是miR

6、NA-146a的直接靶基因。
　　研究結(jié)果:
　　1.通過細(xì)胞表型和生物學(xué)活性的檢測,保證原代培養(yǎng)所得細(xì)胞為狀態(tài)良好的軟骨細(xì)胞,可以進行下一步實驗。
　　2.根據(jù)對比MTT等試驗結(jié)果,選擇對細(xì)胞生物學(xué)特性影響加大,且大部分存活的參數(shù),10Mpa60min作為成模參數(shù)。
　　3.miRNA-146a是芯片結(jié)果中差異最顯著的一個,聯(lián)合基因芯片結(jié)果并根據(jù)生物信息學(xué)方法預(yù)測其靶基因,找出了在芯片結(jié)果中與預(yù)測結(jié)果相一致的潛

7、在靶基因SMAD4,并成功驗證了芯片結(jié)果。
　　4.轉(zhuǎn)染外源性miRNA-146a mimics后,人正常軟骨細(xì)胞中miRNA-146a的表達水平顯著上升。轉(zhuǎn)染外源性miRNA-146a inhibitor后,人正常軟骨細(xì)胞中miRNA-146a的表達水平顯著下調(diào)。
　　5.在正常人軟骨細(xì)胞中上調(diào)miRNA-146a的表達,可以使SMAD4的表達下調(diào)并使VEGF的表達上調(diào),miRNA-146a的表達下調(diào)時可引起相反的作用。<

8、br>　　6.實驗結(jié)果顯示miRNA-146a具有抑制細(xì)胞增殖,促進壓力損傷軟骨細(xì)胞的凋亡的能力。
　　7.SMAD4是miRNA-146a的直接靶基因。
　　研究結(jié)論:
　　1.軟骨細(xì)胞壓力損傷后,miRNA-146a的表達升高,SMAD4表達下調(diào)而VEGF的表達升高。
　　2.SMAD4是miRNA-146a的直接靶基因。
　　3.miRNA-146a可以通過SMAD4介導(dǎo)的方式調(diào)控VEGF的表達,具有