信號調(diào)節(jié)蛋白α負(fù)性調(diào)節(jié)lgE誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫顆粒及細(xì)胞因子合成.pdf

1、研究背景及目的:
　　 近幾年隨著空氣污染等環(huán)境變化，過敏性疾病的發(fā)病率顯著上升，其中包括Ⅰ型超敏反應(yīng)。Ⅰ型超敏反應(yīng)發(fā)病突然，嚴(yán)重時可能威脅生命。在自然界廣泛存在能夠致敏的抗原性物質(zhì)，它們可以經(jīng)呼吸道消化道或皮膚接觸等途徑進(jìn)入體內(nèi)，刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗原特異性免疫球蛋白E(IgE)。隨后IgE分子可以同肥大細(xì)胞表面受體FcεRI穩(wěn)定結(jié)合。FcεRI是一條α鏈、一條β鏈和兩條相同的γ鏈組成的四聚體。α鏈?zhǔn)桥潴w結(jié)合鏈，其胞外區(qū)能和Ig

2、E的Fc段結(jié)合；β鏈和γ鏈有ITAM區(qū)，發(fā)生磷酸化后介導(dǎo)下游信號傳遞。當(dāng)特異抗原再次進(jìn)入體內(nèi)，可以同IgE分子結(jié)合并且使相鄰的兩個FcεRI交聯(lián)，引起肥大細(xì)胞活化。肥大細(xì)胞活化后通過脫顆粒和分泌炎性因子等發(fā)揮其生物學(xué)作用。
　　 體內(nèi)的免疫反應(yīng)強(qiáng)度和范圍受到多種機(jī)制調(diào)節(jié)，其中包括細(xì)胞表面激活性受體和抑制性受體平衡所起到的調(diào)控作用。信號調(diào)節(jié)蛋白家族(signal regulatory protein family)就是一類細(xì)胞表面

3、的抑制性受體。信號調(diào)節(jié)蛋白α(SIRPα)是一種廣泛存在的抑制性受體，屬于免疫球蛋白受體超家族。SIRPα主要表達(dá)在神經(jīng)元細(xì)胞及髓系非淋巴細(xì)胞，如肥大細(xì)胞。SIRP胞外區(qū)具有三個IgSF樣結(jié)構(gòu)域和多個糖基化位點，胞內(nèi)區(qū)帶有免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIMs)，其中含四個酪氨酸殘基，磷酸化后能夠募集含SH2結(jié)構(gòu)域的分子如蛋白磷酸酶SHP-1和SHP-2。
　　 肥大細(xì)胞作為過敏反應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞，抑制性受體SIRPα對其功能的調(diào)節(jié)尚未

4、見系統(tǒng)性報道。我們研究發(fā)現(xiàn)抗原活化肥大細(xì)胞后SIRPα蛋白表達(dá)水平下降，提示SIRPα對肥大細(xì)胞活化可能存在抑制作用。為進(jìn)一步了解SIRPα在肥大細(xì)胞活化過程以及Ⅰ型超敏反應(yīng)中的作用，本課題通過利用差異表達(dá)SIRPα的細(xì)胞進(jìn)行研究，研究了SIRPα在抗原誘導(dǎo)肥大細(xì)胞活化中的作用。重點是SIRPα對肥大細(xì)胞脫顆粒及分泌細(xì)胞因子的影響及相關(guān)信號通路的調(diào)節(jié)。
　　 實驗方法:
　　 1.建立穩(wěn)定高表達(dá)Myc-SIRPα和轉(zhuǎn)染空

5、載體對照的肥大細(xì)胞系。分離培養(yǎng)小鼠骨髓來源肥大細(xì)胞(BMMCs)，合成鑒定具有特異干擾效果signA，瞬時干擾SIRPα表達(dá)，構(gòu)建BMMCssiSIRPα和BMMCscontrol細(xì)胞；
　　 2.采用特異性磷酸化抗體檢測SIRPα差異表達(dá)的肥大細(xì)胞在抗原刺激后p38、JNK、ERK、Akt、NFAT等信號分子的磷酸化水平變化，反映SIRPα對信號通路活化的調(diào)節(jié)；
　　 3.運用熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測SIRPα對NF-

6、κB，NFAT轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)；
　　 4.通過檢測肥大細(xì)胞活化后β-氨基己糖胺酶的釋放，研究SIRPα對肥大細(xì)胞脫顆粒的調(diào)節(jié)；
　　 5.采用Real-timePCR方法檢測肥大細(xì)胞炎性因子的mRNA水平；
　　 6.采用熒光探針檢測SIRPα對細(xì)胞骨架F-actin聚合的調(diào)節(jié)；
　　 7.使用Ca2+指示劑檢測SIRPα對抗原引起肥大活化過程中Ca2+流動的調(diào)節(jié)；
　　 8.用Westernbl

7、ot檢測SIRPα對細(xì)胞骨架微管形成的影響；
　　 10.將BMMCssiSIRPα及陰性對照細(xì)胞輸入肥大細(xì)胞缺失小鼠(c-kitwsh/wsh)體內(nèi)，重構(gòu)肥大細(xì)胞系統(tǒng)。進(jìn)行被動皮膚過敏反應(yīng)，體內(nèi)觀察SIRPα對肥大細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。
　　 11.采用免疫組織沉淀的方法檢測SIRPα與SHP-2的結(jié)合，SHP-2與PI3Kp85和IKKβ的相互作用。
　　 結(jié)果:
　　 1.SIRPα參與抗原誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞

8、活化過程：在肥大細(xì)胞活化過程中，SIRPα蛋白表達(dá)降低，并呈現(xiàn)抗原劑量與時間依賴性。同時，SIRPα發(fā)生磷酸化并募集SHP-1和SHP-2。
　　 2.SIRPα調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞活化后分泌功能：SIRPα顯著抑制肥大細(xì)胞脫顆粒及細(xì)胞因子合成。
　　 3.SIRPα抑制肥大細(xì)胞活化過程中的細(xì)胞骨架改變：SIRPα抑制肥大細(xì)胞活化過程中α-tubulin聚合及F-actin解聚。
　　 4.SIRPα抑制肥大細(xì)胞活化過程

9、中的Ca2+釋放，提示SIRPα通過調(diào)節(jié)Ca2+釋放影響肥大細(xì)胞骨架改變及脫顆粒過程。
　　 5.SIRPα對Ⅰ型超敏反應(yīng)過程中血管滲出的影響：與對照小鼠相比，輸入低表達(dá)SIRPα肥大細(xì)胞的小鼠皮下滲出更加明顯。這進(jìn)一步說明SIRPα抑制肥大細(xì)胞分泌功能。
　　 6.SIRPα抑制細(xì)胞骨架重構(gòu)的機(jī)制：抗原引起肥大細(xì)胞活化過程中，SIRPα明顯抑制PLCγ1磷酸化，從而抑制Ca2+釋放。此外SIRPα明顯抑制Rac-1GT

10、Pase及PAK1的活性，進(jìn)而抑制了微管的形成。
　　 7.SIRPα影響肥大細(xì)胞細(xì)胞因子合成分泌的機(jī)制：抗原誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞活化過程中，SLRPα通過抑制MAPK信號通路磷酸化以及轉(zhuǎn)錄因子NFκB和NFAT活性，抑制肥大細(xì)胞由抗原誘導(dǎo)的炎性因子合成與分泌。
　　 8.SIRPα在抗原誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞活化過程中發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用的機(jī)制：肥大細(xì)胞活化后，SIRPα通過Src家族激酶發(fā)生磷酸化。隨后SIRPα通過競爭結(jié)合SHP-2

11、，影響SHP-2與PI3Kp85及IKKβ的結(jié)合，抑制Akt與NF-κB信號通路。
　　 結(jié)論:
　　 本研究從分子-細(xì)胞-動物水平較深入研究了信號調(diào)節(jié)蛋白SIRPα對肥大細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)SIRPα負(fù)性調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞活化，包括抑制肥大細(xì)胞脫顆粒及炎性因子合成并對體內(nèi)的過敏反應(yīng)能力具有負(fù)向調(diào)控能力。同時本研究進(jìn)一步探討了SIRPα調(diào)節(jié)相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用機(jī)制，證明SIRPα可能通過抑制SHP-2與IKKβ及PI3K