電離輻射對SIK2基因表達的調(diào)控作用研究.pdf

1、目的：
　　從mRNA、蛋白水平和啟動子活性研究電離輻射對SIK2基因表達的影響、作用規(guī)律和相關機制，并構(gòu)建SIK2基因的真核表達載體，為深入探討SIK2的生物學功能及其在細胞放射損傷反應中的作用提供信息和實驗基礎。
　　方法：
　　1.2、4和10Gy60Coγ射線照射肝癌細胞HepG2后，實時定量PCR檢測照射后0、2、4、6、10、12h時間點的SIK2 mRNA表達的時間效應關系；
　　2.1、2、4、6

2、、10Gy60Coγ射線照射肝癌細胞HepG2后6h收集樣品，實時定量PCR檢測SIK2 mRNA表達的劑量效應關系；
　　3.2Gy和10Gy照射后，免疫印跡檢測SIK2蛋白隨照后時間表達水平的變化；流式細胞術分析照射后HepG2細胞的周期變化；
　　4. TdR雙阻斷法同步化HepG2細胞，流式細胞術檢測周期變化及實時定量PCR檢測相應時間點的SIK2 mRNA水平的變化；
　　5.構(gòu)建SIK2啟動子重組報告質(zhì)粒，

3、分析電離輻射誘導后啟動子轉(zhuǎn)錄活性的變化；
　　6.利用DNA重組技術構(gòu)建pCMV-Tag-2B-SIK2的真核表達質(zhì)粒。
　　結(jié)果：
　　1.利用實時定量 PCR技術對輻射誘導 SIK2基因表達的時間效應和劑量效應進行分析，結(jié)果表明?射線照射對SIK2 mRNA表達有誘導表達作用，但是與輻射劑量間沒有明顯的依賴關系（P>0.05）；在時間效應方面，發(fā)現(xiàn)2Gy、4Gy和10Gy照射后10 h時間點，SIK2 mRNA表達

4、水平增加具有顯著性統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　2. Western Blot結(jié)果表明，2Gy照射后SIK2蛋白隨著照后時間的延伸而表達量增加；10Gy照射后表達變化趨勢同2Gy一樣，但增強的幅度相對較弱；1Gy、2Gy、4Gy、6Gy、10Gy照射后，SIK2蛋白表達水平隨劑量的增加而增加。
　　3.流式細胞術檢測2Gy和10Gy輻照后HepG2細胞均在10h左右出現(xiàn)了G2/M期阻滯高峰(P<0.05)，與輻照后SIK

5、2 mRNA出現(xiàn)高峰值的時間點吻合；利用胸腺嘧啶雙阻斷同步化HepG2細胞后，實時定量PCR方法檢測SIK2 mRNA隨細胞周期進程的變化，結(jié)果顯著變化不顯著。由此明確了電離輻射誘發(fā) SIK2 mRNA表達增加不是細胞周期的變化的伴隨結(jié)果（P>0.05）。
　　4.構(gòu)建了SIK2基因啟動子的重組質(zhì)粒，通過雙系統(tǒng)熒光報告基因活性分析，提示SIK2的啟動子包含-2000~+119區(qū)域，可能還向上游繼續(xù)延伸；另外，-2000~+119范

6、圍區(qū)間的啟動子在輻射后10h的轉(zhuǎn)錄活性顯著增加(P<0.05)。
　　5.構(gòu)建了重組真核表達質(zhì)粒pCMV-Tag-2B-SIK2質(zhì)粒，通過順轉(zhuǎn)的方法鑒定質(zhì)粒在293T細胞內(nèi)成功表達，為 SIK2后續(xù)功能和作用機制研究提供實驗基礎。
　　結(jié)論：
　　1.電離輻射對SIK2 mRNA表達有誘導作用，但無明顯的劑量依賴性。
　　2.60Coγ射線誘導SIK2蛋白的表達水平增加，部分作用機制是照射后一定時間范圍內(nèi)SIK2