KGF-2抑制角膜損傷修復(fù)過(guò)程中疤痕的形成及其作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：采用SD大鼠作為受試動(dòng)物，采用堿燒傷構(gòu)建角膜損傷模型，用臨床藥物堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Basic fibroblast growth factors，bFGF)作為陽(yáng)性對(duì)照藥，與角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2（Keratinocyte growth factor-2，KGF-2）進(jìn)行比較，評(píng)價(jià)了KGF-2對(duì)角膜損傷的修復(fù)及抗瘢痕作用。另外，對(duì)于KGF-2如何調(diào)控角膜基質(zhì)細(xì)胞的損傷修復(fù)，如何減少角膜損傷修復(fù)過(guò)程中疤痕形成做了進(jìn)一步的研究。<

2、br>　　方法：將受試藥物以生理鹽水配制成12500AU/50μg/ml;6250AU/25μg/ml;3125AU/12.5μg/ml三個(gè)規(guī)格。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SPF級(jí)SD大鼠。堿燒傷大鼠隨機(jī)分成五組:模型對(duì)照組、bFGF組、KGF-2低劑量組、KGF-2中劑量組、KGF-2高劑量組。速眠新Ⅱ聯(lián)合3％戊巴比妥鈉麻醉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。使用直徑3 mm濾紙片浸于1mol/L NaOH溶液中來(lái)制作雙側(cè)角膜堿燒傷模型。造模后即刻起每日早、中、晚3次各組滴眼

3、給藥，2滴/次，連續(xù)14天。燒傷后每天觀察SD大鼠眼角膜損傷臨床表現(xiàn);分別于燒傷后1-d、3-d、7-d和14-d取角膜，進(jìn)行裂隙燈顯微鏡觀察及角膜彩色照相，滴眼給藥后7-d和14-d取角膜進(jìn)行病理組織學(xué)檢測(cè)。使用組織塊法提取原代的角膜基質(zhì)細(xì)胞;MTT方法檢測(cè)KGF-2促進(jìn)角膜基質(zhì)細(xì)胞增殖作用。KGF-2促進(jìn)角膜基質(zhì)細(xì)胞遷移的作用通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。向培養(yǎng)的原代角膜基質(zhì)細(xì)胞中加入TGF-β1蛋白來(lái)誘導(dǎo)角膜肌成纖維細(xì)胞的形成，以此來(lái)模擬動(dòng)

4、物模型中的角膜損傷，使用WB、細(xì)胞免疫熒光等方法來(lái)檢測(cè)角膜損傷修復(fù)及疤痕形成過(guò)程中相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：眼部一般臨床表現(xiàn):大鼠角膜堿灼傷后，各組大鼠眼瞼、結(jié)膜均出現(xiàn)不同程度的充血、水腫，角膜均觀察到大量新生血管，各組大鼠角膜均有不同程度的渾濁，滴眼給予藥物后大鼠角膜渾濁程度較輕。角膜損傷程度觀察:與模型對(duì)照組相比，KGF-2中劑量組、高劑量組大鼠角膜在治療后第3天的角膜損傷程度評(píng)級(jí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05); KGF-2

5、低劑量組、中劑量組、高劑量組，bFGF組大鼠角膜在治療后第7天的角膜損傷程度評(píng)級(jí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05);各給藥組在治療后第1天、第14天角膜損傷程度評(píng)級(jí)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。上皮細(xì)胞愈合率:與對(duì)照組相比，KGF-2低劑量組、中劑量組大鼠角膜治療后第3天、7天的上皮細(xì)胞愈合率均顯著性增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)，KGF-2高劑量組大鼠角膜傷治療后第1天、3天、7天的上皮細(xì)胞愈合率顯著性增加(p＜0.05)，其余各組

6、各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)均未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。此外，與對(duì)照組相比KGF-2高劑量組大鼠角膜在治療后第3天、7天出現(xiàn)上皮細(xì)胞完全愈合的動(dòng)物例數(shù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)，其余各組大鼠角膜在各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)上皮細(xì)胞完全愈合的動(dòng)物例數(shù)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。病理學(xué)觀察:給藥7天后，bFGF組，KGF-2低、中、高劑量組角膜病理組織結(jié)構(gòu)與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差別;治療14天后，bFGF組，KGF-2低、中、高劑量組角膜厚度較模型對(duì)照組

7、顯著降低。KGF-2（20μg/ml）能明顯促進(jìn)角膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖和遷移作用。培養(yǎng)基中加入TGF-β1(1ng/ml)與對(duì)照組相比明顯增加了疤痕形成相關(guān)蛋白及受體(TGF-β1、TGF-β2、α-SMA、TGF-βR1及TGF-βR2)的表達(dá)，而加入TGF-β1的同時(shí)加入KGF-2，于僅僅加入TGF-β1相比明顯減少了上述指標(biāo)的表達(dá)。此外，僅僅加入KGF-2幾乎完全抑制了上述指標(biāo)的表達(dá)。
　　結(jié)論：在本試驗(yàn)條件下，KGF-2在12