P120和IQGAP1在氣道上皮損傷修復過程中的作用研究.pdf

1、第一部分P120在脂多糖致氣道上皮細胞炎癥反應中對NF-κB信號通路的影響實驗背景氣道上皮是呼吸系統(tǒng)對抗有害刺激的第一道防線，各種病原微生物在機體抵抗力低下時均可引起肺部感染性疾病。其中以革蘭陰性菌細胞壁的主要成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）為主要致病因素，不僅引起肺部炎癥反應，還可使原有肺部疾病發(fā)展和加重。氣道上皮在致病因素的攻擊下受到損傷，隨后啟動自身修復機制。LPS致氣道上皮細胞損傷后，可促使細胞發(fā)生壞死

2、、凋亡和分泌前炎癥因子等反應，這些反應共同推動肺損傷的發(fā)展過程。大量研究證明，核因子-κB（nuclear factor，NF-κB）信號途徑參與調(diào)節(jié)細胞生長、分化、增殖、存活、凋亡及炎癥反應過程中多種基因的轉(zhuǎn)錄，與LPS引起的肺損傷密切相關。然而，LPS導致肺部炎癥反應的分子機制還遠未闡明。NF-κB在正常情況下與其抑制蛋白IκB結合以無活性的形式存在于靜息細胞胞漿中。外界刺激可引起IκB被迅速磷酸化、泛素化而降解，從而釋放NF-κB

3、活性亞單位轉(zhuǎn)位入核，激活下游靶基因轉(zhuǎn)錄。P120-catenin(p120)是連環(huán)素家族成員，可在細胞膜上與上皮鈣粘蛋白（E-Cadherin，E-Cad）相互結合而調(diào)節(jié)細胞粘附。近年來有研究表明，p120通過調(diào)節(jié)NF-κB活性參與表皮炎癥反應。我們推測在氣道炎癥反應中，p120也可能通過NF-κB信號途徑發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。實驗目的本實驗使用脂多糖刺激建立體外氣道炎癥反應模型，初步探討脂多糖刺激后氣道上皮細胞中p120的表達變化及其對NF-

4、κB信號通路的影響，從而進一步分析氣道炎癥發(fā)生發(fā)展的機制。實驗方法使用脂多糖刺激建立體外氣道炎癥反應模型；采用免疫熒光共聚焦成像、Western blot、核漿分離方法檢測p120、NF-κB、IκBα等蛋白表達及定位變化；采用熒光定量PCR、定量酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）檢測IL-8表達變化；采用熒光素酶報告基因分析的方法檢測NF-κB的活性；通過瞬時轉(zhuǎn)染及小干擾RNA技術改變細胞中p120的表達量再檢測p120對NF-κB信號途

5、徑的影響。實驗結果（1）細胞瞬時轉(zhuǎn)染NF-κB報告質(zhì)粒后，報告基因分析結果顯示，LPS刺激可引起氣道上皮細胞中NF-κB信號的活化；同時熒光定量PCR和ELISA結果顯示NF-κB靶基因IL-8--一種前炎癥因子的表達亦有明顯增多。（2）p120在正常氣道上皮細胞中含量豐富，而LPS刺激后，其表達迅速下調(diào)，早在15 min時即可表現(xiàn)出來?；谝陨蟽牲c，我們推測在LPS所致氣道炎癥反應中，p120與NF-κB信號途徑可能存在某種聯(lián)系。接下

6、來，我們先探討NF-κB信號活化的機制。（3）實驗發(fā)現(xiàn)，在LPS刺激15 min～30 min時，NF-κB的抑制蛋白IκBα迅速降解至幾近消失；其磷酸化形式在正常細胞中幾乎檢測不到，但在LPS處理15 min～30 min這段時間內(nèi)含量顯著增加，在IκBα恢復正常水平后，p-IκBα又再次消失不見。（4）核漿分離試驗及免疫熒光共聚焦結果均顯示LPS促使NF-κB活性亞單位p65發(fā)生核內(nèi)轉(zhuǎn)位。結果（3）和（4）表明，LPS在氣道上皮細胞

7、中引起的NF-κB活化是通過使IκBα發(fā)生磷酸化降解，從而導致p65由NF-κB/IκB復合體中釋放并轉(zhuǎn)位入核激活相應靶基因轉(zhuǎn)錄。接下來，我們通過對細胞轉(zhuǎn)染p120質(zhì)?；蛐「蓴_RNA，研究p120對NF-κB信號活化的影響。（5）實驗結果顯示，過表達p120可以部分抑制NF-κB的活性及IL-8的表達，但免疫熒光及核漿分離結果依然可以觀測到p65核轉(zhuǎn)位。（6）小干擾RNA敲低p120的表達后，免疫熒光結果顯示，LPS可引起p65更強烈的

8、核染色；同時核漿分離產(chǎn)物的免疫印跡結果也證實阻斷p120表達可進一步促進LPS誘導的p65核轉(zhuǎn)位。（7）阻斷p120的表達可大大提升NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性及其靶基因IL-8的表達。實驗結論本實驗表明：（1）LPS可導致氣道上皮細胞中p120表達下調(diào)。（2）LPS可誘導氣道上皮細胞NF-κB信號的活化及其靶基因IL-8的表達。（3）NF-κB信號途徑的活化是通過IκBα的磷酸化降解釋放p65入核實現(xiàn)的。（4）過表達p120可部分抑制NF-κ

9、B信號的活化；敲低p120能顯著促進NF-κB信號的活化。本實驗提示：在LPS引起的氣道炎癥反應中，p120可能負性調(diào)節(jié)NF-κB信號途徑的活化，從而抑制氣道炎癥反應。第二部分 IQGAP1在吸煙致氣道上皮損傷修復中對細胞粘附的影響實驗背景
　　 大量研究表明，吸煙可從多個方面損傷氣道上皮細胞，更是導致慢性阻塞性肺疾病（COPD）和支氣管源性肺癌發(fā)生發(fā)展的確切因素。然而，吸煙致氣道上皮損傷的具體機制仍未完全闡明。上皮細胞損傷后，

10、立即啟動自我修復過程。這是一個步驟繁雜的過程，包括細胞延伸、遷移和增殖。而細胞間粘附的改變表現(xiàn)在損傷修復的初始階段，因此對細胞粘附的研究顯得非常有意義。已有研究證實，IQGAP1參與許多生命活動，是一個多功能蛋白。作為Rho家族GTPases成員Rac1和Cdc42的一個重要的效應因子，IQGAP1不僅參與調(diào)節(jié)細胞骨架，影響細胞粘附、極化和遷移，還可能介導β-catenin/TCF信號的轉(zhuǎn)錄活化，從而引起其下游細胞增殖相關基因的表達。有

11、研究顯示IQGAP1可能通過β-catenin調(diào)節(jié)細胞粘附，然而具體機制并不明了。由于IQGAP1可與作為細胞粘附成分和Wnt信號通路成員的β-catenin結合，因此研究IQGAP1在損傷修復中的作用就顯得尤為重要。有報導指出，IQGAP1在肺組織中高表達。我們推測IQGAP1在氣道上皮損傷修復中可能發(fā)揮作用，并探討其可能機制。實驗目的通過建立香煙煙霧提取物（CSE）損傷氣道上皮的體外模型，觀察IQGAP1在損傷修復過程中的表達及定位

12、變化及其對細胞粘附復合體成員β-catenin的影響，初步研究其對氣道上皮損傷修復中細胞粘附改變的影響，并為進一步探討細胞增殖修復提供依據(jù)。實驗方法使用CSE建立體外氣道上皮損傷模型，首先使用相差顯微鏡觀察氣道上皮細胞在CSE刺激下的形態(tài)學變化，同時采用MTT方法檢測不同濃度下細胞活力的變化。接著應用Western blot、免疫熒光共聚焦成像、免疫沉淀等技術觀察CSE刺激后IQGAP1的表達、定位變化及其對細胞粘附復合體的影響。最后通

13、過瞬時轉(zhuǎn)染野生型IQGAP1和小干擾RNA，采用核漿分離等方法檢測過表達或敲低IQGAP1對β-catenin的影響。實驗結果（1）在相差顯微鏡下觀察，可見培養(yǎng)的氣道上皮細胞呈現(xiàn)上皮細胞典型的鋪路石狀形態(tài)，立體感強，微凸起，細胞間連接緊密。在CSE損傷后，細胞伸展扁平，細胞間間隙增寬，伸出突起相接觸，更高濃度的CSE致使細胞皺縮變圓，死亡增加。（2）MTT結果顯示，低濃度CSE可促進細胞增殖，而高濃度則引起細胞活力降低。（3）采用Wes

14、tern blot和免疫熒光技術，我們發(fā)現(xiàn)，CSE促使氣道上皮細胞中IQGAP1呈現(xiàn)時間依賴性過表達，且其定位信號由細胞連接處擴散至整個胞漿。更為有意義的是，我們通過免疫熒光和免疫印跡發(fā)現(xiàn)IQGAP1可與β-catenin結合，CSE刺激后，這種結合變得更強，而β-catenin與α-catenin的結合銳減。（4）進一步通過使用瞬時轉(zhuǎn)染技術，我們發(fā)現(xiàn)IQGAP1過表達不僅可以增加β-catenin在細胞內(nèi)聚集，還可以促使積聚的β-ca

15、tenin轉(zhuǎn)位入核。而用干擾RNA阻斷IQGAP1的表達后，β-catenin在胞漿內(nèi)的聚集減少，其入核也受到影響。實驗結論本實驗表明：（1）CSE可在體外誘導氣道上皮細胞過表達IQGAP1。（2）CSE減弱β-catenin與粘附復合體中α-catenin的結合，但加強其與IQGAP1的結合（3）過表達IQGAP1促使β-catenin在胞漿中積聚并進而轉(zhuǎn)位入核。本實驗提示：IQGAP1通過與α-catenin競爭結合β-cateni