P120及NF-κB在脂多糖致小鼠急性肺損傷氣道上皮中的表達(dá)變化及相關(guān)機(jī)制.pdf

1、一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br>　　本實(shí)驗(yàn)使用脂多糖(LPS)氣管內(nèi)注射建立小鼠急性肺損傷模型(ALI),檢測在氣道損傷修復(fù)過程中p120蛋白的表達(dá)變化及在細(xì)胞內(nèi)的定位、NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)變化及細(xì)胞因子IL-8的表達(dá)變化,初步探討小鼠氣道炎癥發(fā)生過程中的有關(guān)機(jī)制。
　　二、實(shí)驗(yàn)方法
　　C57小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組1d、4d、7d、14d組和對(duì)照組,每組8只。實(shí)驗(yàn)組經(jīng)氣管內(nèi)注射LPS(5mg/kg),對(duì)照組氣管內(nèi)注射等量生理鹽

2、水,分別于注射后1d、4d、7d及14d取肺組織。采用HE染色觀察各組小鼠的氣道上皮形態(tài)學(xué)變化;免疫組織化學(xué)方法檢測p120在氣道上皮細(xì)胞的表達(dá)及在細(xì)胞內(nèi)的定位;Westernblot方法分別檢測小鼠肺組織內(nèi)p120、NF-κB亞基p65、p-IκBα及IκBα等表達(dá)水平的變化;ELISA(定量酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn))檢測小鼠肺組織勻漿上清液中NF-κB信號(hào)通路下游靶基因之一細(xì)胞因子IL-8的表達(dá)變化。
　　三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1、

3、HE染色顯示:對(duì)照組小鼠支氣管黏膜上皮細(xì)胞排列整齊,未見明顯損傷及修復(fù)性變化。實(shí)驗(yàn)組小鼠氣道上皮呈現(xiàn)了損傷及損傷后增殖、修復(fù)的形態(tài)學(xué)變化。實(shí)驗(yàn)1d組小鼠未出現(xiàn)明顯的急性炎癥變化,氣道上皮連續(xù)性較好,肺泡也無明顯的病理變化。實(shí)驗(yàn)4d組小鼠氣道黏膜上皮細(xì)胞出現(xiàn)明顯的壞死、脫落,細(xì)支氣管腔內(nèi)及管壁周圍見多量炎癥細(xì)胞浸潤,肺泡間隔明顯增寬,支氣管旁血管擴(kuò)張、充血,血管周圍見多量炎癥細(xì)胞滲出。實(shí)驗(yàn)7d組小鼠支氣管壁周圍仍見較多炎癥細(xì)胞浸潤,但部分

4、區(qū)域肺泡間隔較前有所恢復(fù)。實(shí)驗(yàn)14d組小鼠細(xì)支氣管壁炎細(xì)胞浸潤減少,肺泡間隔基本恢復(fù)正常,部分區(qū)域細(xì)支氣管黏膜上皮細(xì)胞排列緊密,上皮層次稍增多,呈現(xiàn)增殖變化。
　　2、免疫組化染色顯示:p120在對(duì)照組小鼠氣道上皮呈現(xiàn)圍繞氣道上皮細(xì)胞連續(xù)棕黃色線狀表達(dá),在實(shí)驗(yàn)組小鼠氣道上皮的細(xì)胞膜表達(dá)呈現(xiàn)先減少后逐漸恢復(fù)趨勢。實(shí)驗(yàn)1d組,p120仍表現(xiàn)為沿氣道上皮細(xì)胞膜呈棕黃色連續(xù)線狀表達(dá);實(shí)驗(yàn)4d組和7d組,p120在小鼠氣道上皮細(xì)胞膜上表達(dá)明

5、顯減少,部分區(qū)域見細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá);實(shí)驗(yàn)14d組,部分區(qū)域恢復(fù)p120在小鼠氣道上皮細(xì)胞膜上棕黃色連續(xù)線狀表達(dá)。各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比均有明顯的差異(p<0.05)。
　　3、Westernblot檢測顯示:
　　1)與對(duì)照組小鼠肺組織內(nèi)p120表達(dá)水平相比較,實(shí)驗(yàn)組小鼠肺組織內(nèi)p120蛋白水平呈現(xiàn)出先降低后逐漸恢復(fù)的趨勢,實(shí)驗(yàn)1d組和4d組p120蛋白水平下降較明顯,7d組和14d組p120蛋白水平有所上升,但仍低于對(duì)照組。各實(shí)

6、驗(yàn)組與對(duì)照組之間p120蛋白水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
　　2)與對(duì)照組小鼠肺組織內(nèi)NF-κB表達(dá)水平比較,實(shí)驗(yàn)組小鼠肺組織內(nèi)NF-κB表達(dá)呈現(xiàn)出先增加、后逐漸降低的動(dòng)態(tài)變化,其表達(dá)變化的趨勢與p120的變化趨勢相反,即實(shí)驗(yàn)1d組和4d組NF-κB表達(dá)增加,7d組和14d組NF-κB表達(dá)逐漸降低至接近對(duì)照組水平。實(shí)驗(yàn)1d組、4d組和7d組與對(duì)照組比較NF-κB表達(dá)差異明顯,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05);實(shí)驗(yàn)14d組

7、與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3)與對(duì)照組比較,小鼠肺組織內(nèi)p-IκBα呈現(xiàn)先增加后減少趨勢,IκBα則先因磷酸化增加而表達(dá)減少,后因磷酸化降低而表達(dá)增加。實(shí)驗(yàn)1d組、4d組及7d組與對(duì)照組之間差異明顯,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05),實(shí)驗(yàn)14d組與對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4、ELSIA結(jié)果顯示:LPS刺激C57小鼠后,IL-8的表達(dá)水平先增加后降低。各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組表達(dá)水平差異明顯,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.