哮喘豚鼠氣道上皮損傷機制及還原型谷胱甘肽的保護作用.pdf

1、背景與目的:
　　支氣管哮喘（簡稱哮喘）是最常見的慢性呼吸道疾病之一，不僅嚴重影響個人健康，而且造成了巨大的社會負擔。流行病資料顯示近20多年來哮喘患病率在世界大部分地區(qū)正以驚人的速度上升，已成為全球關注的公眾健康問題。在我國，隨著經濟的快速發(fā)展和生存環(huán)境的改變，以及人們生活模式和飲食結構的變化，支氣管哮喘的患病率也與日俱增，1990年我國城市0～14歲兒童哮喘患病率為0.9％，2000年平均累計患病率達1.5％，10年間上升了6

2、4.8％以上，成人患病率亦高達1.0％左右。如此高的患病率對哮喘的防治提出了更高的要求。在這樣的背景下，2012年全球支氣管哮喘防治創(chuàng)議(GINA)將哮喘定義為:哮喘是由多種細胞包括氣道的炎性細胞和結構細胞（如嗜酸粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞、平滑肌細胞、氣道上皮細胞等）和細胞組分(Cellularwlements)參與的氣道慢性炎癥性疾病。
　　目前，在哮喘研究上還面臨著諸多問題，特別是哮喘發(fā)病機制極為復雜，涉及到多

3、種炎癥細胞和細胞組分，除嗜酸細胞和肥大細胞是最重要的效應細胞，T細胞和氣道上皮細胞通過分泌多種細胞因子起到調控作用，樹突狀細胞的作用是將變應原呈遞給炎癥細胞，這些炎癥細胞和細胞因子構成了復雜的網絡，它們之間的相互作用、彼此影響和調控。其中，炎癥因子:IL-4、5、8，TNF-α和INF-γ等炎癥因子，均參與了哮喘的發(fā)生和發(fā)作，各種細胞之間的相互作用是通過細胞因子或某些神經介質完成，而這些細胞因子又通過不同機制引起更多的炎細胞聚集，進一步

4、加重氣道的損傷，最后出現氣道重構，這種在慢性炎癥刺激下發(fā)生的氣道壁結構的改變，涉及細胞外基質聚積、氣道平滑肌增厚與上皮下纖維化、肌成纖維細胞(myofibroblast)增生、炎癥細胞浸潤、杯狀細胞增生與腺體肥大等等，其中以基底膜下Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原纖維、纖維連接素等呼吸道細胞外基質沉積和成纖維細胞活化、增殖表現最明顯，最終導致哮喘的頑固性反復發(fā)作，影響肺功能。
　　正常情況下，機體有完善的抗氧化系統，體內活性氧(ROS)的產生與消

5、除處于一種動態(tài)平衡狀態(tài)，然而，在哮喘氣道中，在活性氧和抗氧化劑精確的平衡被破壞的原因是ROS過量產物。這種失衡也可能是抗氧化劑的耗竭所致，它的影響是在整個氣道內襯液和細胞外空間產生更多的氧化環(huán)境，大量流行病學和臨床證據支持增加ROS與哮喘發(fā)病機制的聯系。與正?？刂苹颊呦啾龋谙∪怂杉纳飿颖景l(fā)現較高水平氧化應激增高的分子。另有研究表明哮喘病人氧化應激的增強與肺功能減退有關。盡管這些發(fā)現，關于氧化應激的增強是起到慢性炎癥的結果，還

6、是變應性炎癥發(fā)展的的主要原因，這一點仍然不清楚。此外，氧應激狀態(tài)可能是細胞凋亡發(fā)生的一個重要媒介，許多凋亡刺激伴有氧化應激，而許多凋亡的抑制劑具有抗氧化活性或加強細胞抗氧化能力。研究發(fā)現哮喘患者氣道上皮細胞凋亡存在不同程度異常，Bucchieri等通過對哮喘患者進行肺部活檢發(fā)現其氣道上皮細胞凋亡增加，同時，體外實驗也證明，在強氧化劑的作用下哮喘患者的氣道上皮細胞更容易發(fā)生凋亡。但氧化應激與氣道上皮細胞的凋亡及哮喘反復發(fā)作的關系尚無定論。

7、
　　機體存在的兩大抗氧化系統，其一，過氧化物歧化酶(SOD)包含一個18個氨基酸的羥基末端區(qū)域包含有6個正電荷的氨基酸，在肺細胞外空間這個正電荷區(qū)域使SOD結合至肝素和其它負電荷分子上。主要在氣道和內皮細胞表達，存在每個組織的細胞中，通過將過氧化基團轉變成過氧化氫減少氧化劑負荷，從而起到抗氧化作用。而型谷胱甘肽(ReducedGlutathione，GSH)是一個包括巰基的三肽（左旋谷氨酰半胱氨酸-甘氨酸），是另一個重要的有保護

8、作用的抗氧化劑，具有抗自由基和其它氧化劑的作用。它的作用包括調節(jié)氧化還原信號的傳遞，調節(jié)細胞增殖，重塑細胞外基質，屏蔽抗蛋白酶、細胞調亡和線粒體呼吸。谷胱甘肽氧化還原系統在細胞內保持動態(tài)平衡對維持細胞的正常生理功能是非常重要的，是肺組織細胞中提供了最重要的抗氧化劑防御系統。小樣本的臨床對照研究顯示，還原型谷胱甘肽具有穩(wěn)定氣道上皮細胞，減輕哮喘的作用，其機制可能與其抗氧化作用有關。
　　絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activ

9、atedProteinKinases，MAPK)家族信號轉導系統是一個非常保守的信號系統，存在于從酵母到哺乳動物的細胞中。p38MAPK是其家族中的一個成員，能被炎癥、應激、損傷啟動的信號激活，參與細胞的炎癥和凋亡[5，6]。支氣管哮喘炎癥反應是否通過MAPK通路激活的上皮凋亡尚未可知。糖皮質激素治療已經被證明在大多數情況下能很好地控制氣道炎癥，但對氣道重塑特別是氣道上皮細胞凋亡的作用仍然是有爭議的。
　　對象與方法:
　　

10、1、建立哮喘豚鼠模型:清潔級健康雄性豚鼠48只，體重450±25g，隨機分組后，參照目前國內外通用方法制作:，于第1、8天分別腹腔注射2％卵蛋白2ml;第21天將單只豚鼠置于半封閉的容器中超聲霧化吸人2％卵蛋白5分鐘誘喘。如該豚鼠出現劇烈咳嗽、打噴嚏、呼吸困難、喘息、呼氣費力或點頭樣呼吸，聽診聞及喘鳴音，這表明哮喘模型制作成功。
　　2、干預措施和評估方法:建立支氣管哮喘豚鼠模型后，收集肺泡灌洗液和肺組織標本，檢測肺泡灌洗液的白細

11、胞及分類、細胞因子的分布情況，同時檢測肺組織的光鏡病理改變，并檢測相關炎癥因子。然后，以還原型谷胱甘肽為干預藥物，探索GSH對支氣管哮喘上皮細胞的保護作用及可能機制，最后通過分組分析比較，揭示MAPK通路在炎癥反應所導致的哮喘氣道上皮細胞凋亡中的作用和影響。
　　3、統計學分析:所有數據采用SPSS13.0分析軟件進行處理分析，計量資料用(x)±s表示，樣本均數比較采用t檢驗和單因素方差分析(one-wayANOVA)，兩兩比較采

12、用LSD檢驗;相關分析采用檢驗水準a=0.05。
　　結果:
　　1.第一部分中:模型組豚鼠進食減少，生長緩慢，精神萎靡，活動量減少，行動遲緩，口唇發(fā)紺。與正常對照組相比，模型組BALF中嗜酸性粒細胞和上皮細胞計數顯著升高，差異具有統計學意義(均有P＜0.001)。光鏡顯示模型組管腔周圍有大量炎性細胞浸潤，支氣管粘膜有破壞現象，部分剝蝕，纖毛細胞損失，平滑肌斷裂，基底膜破壞，管腔內粘液和細胞團塊堆積。與正常對照組相比，模型組

13、SOD測定顯著降低（124.69±17.64vs164.87±22.35P＜0.0001），T-AOC亦顯著低于對照組（6.94±1.58vs19.43±5.84P＜0.0001）。而ROS測定結果顯著高于對照組(27.31±4.77vs7.24±1.64P＜0.0001)。氣道上皮細胞進行TUNEL染色后，模型組凋亡的平均比例為34.13±4.67％，顯著高于對照組的2.12±0.84％，差異具有統計學意義(t=61.20，P＜0.0

14、01)。進一步的相關分析顯示:上皮細胞凋亡比例與肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞和上皮細胞數成正相關關系（r=0.792，P=0.002和r=0.746，P=0.005。），分別有r=-0.651，P=0.004和r=-0.507，P=0.017，與SOD、T-AOC呈負相關，而與ROS呈正相關。
　　2.第二部分:還原型谷胱甘肽組和地塞米松組豚鼠性狀較模型組輕，存在一定程度的精神萎靡，活動量減少，行動遲緩，但無口唇發(fā)紺現象。各組豚鼠支氣

15、管肺泡灌洗液嗜酸性粒細胞存在整體差異(F=168.326，P＜0.001)，模型組嗜酸性粒細胞比例最高。還原性谷胱甘肽組BALF中嗜酸性粒細胞和上皮細胞計數顯著降低，差異具有統計學意義（均有P＜0.001）。谷胱甘肽組和地塞米松組肺泡灌洗液中TNF-α顯著低于模型組(P＜0.001)，而INF-γ水平顯著高于模型組(P＜0.001)，差異具有統計學意義。光鏡顯示谷胱甘肽組支氣管周炎性細胞浸潤相對較輕，上皮細胞較完整，基底膜破壞相對較輕。

16、在肺組織GSH的測定中發(fā)現，谷胱甘肽組豚鼠肺組織GSH水平接近正常對照組，顯著高于模型組，差異具有統計學意義（P＜0.001），而γ-GCS和TNF-α陽性區(qū)光密度面積顯著低于模型組（均有P＜0.001）。在對凋亡的檢測中發(fā)現，各組豚鼠氣道上皮細胞均存在不同程度的凋亡現象，還原型谷胱甘肽組和地塞米松組豚鼠T-AOC水平接近正常對照組，而顯著高于模型組(P＜0.05)。電鏡觀察顯示:模型組支氣管上皮細胞重度腫脹，電子密度降低，細胞膜溶解、

17、消失，細胞質內容溢出，細胞結構消失。谷胱甘肽組支氣管上皮細胞呈單層柱狀排列，纖毛細胞核圓形居中，核內常染色質豐富，電子密度降低。
　　3.第三部分:大體觀察地塞米松和SB203580干預組未見肺膨隆，但局部稍充血，表面基本光滑。光鏡下，哮喘組豚鼠肺組織病理變化（支氣管周炎癥細胞浸潤、氣道上皮細胞脫落、氣道平滑肌增殖、黏液栓塞以及杯狀細胞肥大等）、氣道上皮細胞凋亡(cleavedcaspase-3染色陽性細胞)、肺組織磷酸化p38M

18、APK表達水平及BALF中IL-4含量正常對照組顯著增加(P＜0.01)，肺組織磷酸化p38MAPK表達水平、BALF中IL-4含量呈顯著正相關(r=0.77、0.63，P＜0.01);DEX干預組上述指標較哮喘組顯著降低(P＜0.01)，肺組織病理學損傷程度明顯減輕;SB203580組豚鼠肺組織病理變化、氣道上皮細胞凋亡、肺組織磷酸化p38MAPK表達水平較哮喘組顯著降低（P＜0.01），而BALF中IL-4含量較哮喘組降低無顯著意義