香煙煙霧提取物對氣道上皮細胞損傷作用機制的研究.pdf

1、呼吸道上皮是肺抵御外界環(huán)境損傷的第一道門戶。病原微生物和環(huán)境污染等理化因子的刺激，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)完整性破壞和功能喪失，是慢性阻塞性肺疾病(chronicobstructivepulmonarydisease，COPD)和哮喘等很多呼吸道疾病的起始環(huán)節(jié)和病理基礎(chǔ)。氣道上皮細胞完整性的修復(fù)和維持有助于預(yù)防和延緩呼吸道疾病的發(fā)生發(fā)展，細胞的粘附遷移和增殖是其修復(fù)能力的重要標志。粘著斑激酶(focaladhesionkinase，F(xiàn)AK)是人們發(fā)現(xiàn)

2、的與腫瘤細胞和成纖維細胞等很多細胞粘附遷移和增殖活性密切相關(guān)的非受體蛋白酪氨酸激酶，細胞內(nèi)源性FAK家族激酶相互作用蛋白200(FAK-familyinteractingproteinof200kDa，F(xiàn)IP200)對FAK活性有負調(diào)節(jié)作用；香煙煙霧提取物(cigarettesmokingextract，CSE)是導(dǎo)致呼吸道上皮細胞損傷的重要因素，F(xiàn)AK和FIP200在CSE所致氣道上皮細胞損傷粘附遷移和增殖中的作用如何?我們作了以下三

3、方面的研究。 一、局灶粘著斑激酶對氣道上皮細胞粘附遷移和增殖的影響目的：研究FAK磷酸化對細胞外基質(zhì)成份誘導(dǎo)的氣道上皮細胞粘附遷移和增殖的影響，探討粘著斑激酶活化對氣道上皮細胞損傷后修復(fù)影響的機制。 方法：通過纖維連接蛋白(finbronectin，F(xiàn)N)誘導(dǎo)培養(yǎng)氣道上皮細胞，用細胞計數(shù)法測定細胞粘附率；用損傷修復(fù)試驗測定細胞遷移速度；利用四唑鹽(MTT)比色實驗研究氣道上皮細胞增殖情況，采用流式細胞術(shù)分析氣道上皮細胞細

4、胞周期各期分布，以Westernblot和免疫共沉淀檢測FAK表達水平及其酪氨酸磷酸化程度；以FAK反義寡核苷酸(oligodeoxynucleotides，ODNs)經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細胞，觀察其對FAK磷酸化、細胞增殖、細胞在細胞周期各期分布和細胞粘附遷移的影響。 結(jié)果：FN誘導(dǎo)的氣道上皮細胞MTT吸光度值明顯增強，G1期細胞數(shù)量明顯減少，S期和G2期細胞數(shù)量明顯增多，細胞粘附率和遷移速度顯著增高，同時FAK表達水平及其酪氨酸磷酸

5、化程度顯著增高；經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染了反義FAK寡核苷酸的氣道上皮細胞MTT吸光度值顯著降低，G1期細胞數(shù)明顯增多，S期和G2期細胞數(shù)顯著減少，細胞粘附率和遷移速度顯著降低，F(xiàn)AK表達水平及其酪氨酸磷酸化程度降低，且與G1期細胞數(shù)量的增多呈顯著負相關(guān)，與S期、G2期細胞數(shù)量、MTT吸光度值、細胞粘附率和遷移速度呈明顯正相關(guān)。 結(jié)論：FAK是細胞外基質(zhì)誘導(dǎo)氣道上皮細胞增殖的重要信號分子，其活化促進氣道上皮細胞的粘附遷移和增殖，在氣道上皮細

6、胞損傷后修復(fù)過程中起重要作用。 二、FIP200對氣道上皮細胞粘附遷移和增殖的影響目的：研究FIP200(FAK-familyinteractingpro矗mof200kDa)對細胞外基質(zhì)成份FN誘導(dǎo)的呼吸道上皮細胞粘附遷移和增殖的影響及其作用機制。方法：通過FN誘導(dǎo)培養(yǎng)呼吸道上皮細胞粘附遷移和增殖，以FIP200反義寡核苷酸(ODNs)經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細胞；用細胞計數(shù)法測定細胞粘附率；用損傷修復(fù)試驗測定細胞遷移速度；利用四唑鹽(M

7、TT)比色實驗研究呼吸道上皮細胞增殖情況；采用流式細胞術(shù)分析呼吸道上皮細胞細胞周期各期分布情況；以Westernblot檢測FIP200和FAK蛋白表達水平；以免疫共沉淀檢測FIP200和FAK結(jié)合情況和FAK磷酸化程度。結(jié)果：FN誘導(dǎo)的呼吸道上皮細胞MTT吸光度明顯增強，G1期細胞數(shù)量明顯減少，S期和G2期細胞數(shù)量明顯增多，同時FAK表達水平及其酪氨酸磷酸化程度顯著增高，F(xiàn)IP200表達有降低趨勢，F(xiàn)AK與FIP200的結(jié)合程度顯著減

8、低；經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染了反義FIP200寡核苷酸的氣道上皮細胞MTT吸光度值顯著增高，G1期細胞數(shù)明顯減少，S期和G2期細胞數(shù)顯著增多，細胞粘附率和遷移速度顯著增高，F(xiàn)IP200表達水平顯著降低，F(xiàn)AK表達水平無明顯變化，與FIP200結(jié)合的FAK顯著降低，F(xiàn)AK酪氨酸磷酸化程度明顯增高；而且FIP200表達水平及FIP200與FAK的結(jié)合程度與G1期細胞數(shù)量呈顯著正相關(guān)，與S期、G2期細胞數(shù)量、MTT吸光度、細胞粘附率和遷移速度呈明顯負相關(guān)

9、。 結(jié)論：內(nèi)源性FIP200和FAK的結(jié)合抑制FAK的活化，從而抑制呼吸道上皮細胞粘附遷移和增殖，內(nèi)源性FIP200作為FAK的抑制劑而存在。 三、香煙煙霧提取物對氣道上皮細胞粘附遷移和增殖的影響及其機制研究 目的：研究香煙煙霧提取物對氣道上皮細胞粘附遷移和增殖的影響及其作用機制。 方法：通過FN誘導(dǎo)培養(yǎng)氣道上皮細胞，以CSE干預(yù)細胞；用細胞計數(shù)法測定細胞粘附率；用損傷修復(fù)試驗測定細胞遷移速度；利用四唑鹽

10、(MTT)比色實驗研究呼吸道上皮細胞增殖情況；采用流式細胞術(shù)分析呼吸道上皮細胞細胞周期各期分布情況；以Westernblot檢測FIP200和FAK蛋白表達水平；以免疫共沉淀檢測FIP200和FAK結(jié)合情況和FAK磷酸化程度。 結(jié)果：與對照組相比，CSE干預(yù)的氣道上皮細胞MTT吸光度明顯降低，G1期細胞數(shù)量明顯增多，S期和G2期細胞數(shù)量明顯減少，細胞粘附率和遷移速度均顯著降低(P均＜0.01)，F(xiàn)IP200mRNA、FIP200

11、的表達水平以及FIP200與FAK的連接均顯著增高(P均＜0.01)，而且這些變化均隨CSE干預(yù)時間的延長和CSE濃度的增大而增大；氣道上皮細胞FIP200表達水平和FIP200與FAK連接的增高均與G1期細胞數(shù)量的增多呈正相關(guān)(P均＜0.01)，與S期和G2期細胞數(shù)量的減少及細胞粘附率和遷移速度的降低呈負相關(guān)(P均＜0.01)。 結(jié)論：CSE導(dǎo)致氣道上皮細胞高表達FIP200，并促進FIP200與FAK的連接而抑制FAK活化，