Integrinβ4在氣道上皮細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)功能穩(wěn)態(tài)中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：氣道上皮細(xì)胞是呼吸系統(tǒng)與外界接觸的第一道天然屏障，越來(lái)越多的研究表明氣道上皮細(xì)胞可以通過(guò)自身的機(jī)械性屏障功能、分泌功能、代謝功能與抗原呈遞功能等過(guò)程參與對(duì)呼吸系統(tǒng)的應(yīng)激反應(yīng)及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。因此，氣道上皮的結(jié)構(gòu)與功能穩(wěn)態(tài)是呼吸系統(tǒng)維持正常換氣功能和防御功能的細(xì)胞基礎(chǔ)。氣道上皮細(xì)胞是一層排列緊密的假?gòu)?fù)層上皮細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞與細(xì)胞之間以及細(xì)胞與基底膜之間的粘附氣道上皮細(xì)胞整齊排列并粘附在基底膜上。氣道上皮的結(jié)構(gòu)性整合粘附依賴于氣道上皮

2、表達(dá)的粘附分子家族。Integrinβ4是氣道上皮細(xì)胞表達(dá)的一類結(jié)構(gòu)性粘附分子蛋白，通過(guò)半橋粒結(jié)構(gòu)介導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞與基底膜的粘附及整合。與整合素其它家族成員不同，integrinβ4胞內(nèi)含有一段特殊的結(jié)構(gòu)性功能域，提示其可能參與氣道上皮細(xì)胞的一系列信號(hào)通路，進(jìn)而與氣道上皮的應(yīng)激反應(yīng)、功能穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)。但是，除了粘附功能以外，integrinβ4在氣道上皮的表達(dá)及功能屬性的相關(guān)研究很少。本實(shí)驗(yàn)室在先前的研究中應(yīng)用基因芯片及生物信息學(xué)方法篩

3、選了哮喘病人外周血白細(xì)胞差異表達(dá)的粘附分子，發(fā)現(xiàn)integrinβ4基因在哮喘病人中表達(dá)明顯下調(diào)，提示integrinβ4表達(dá)改變可能與哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病密切相關(guān)，但具體的內(nèi)在機(jī)制仍不清楚。因此，本課題研究主要包括以下幾個(gè)部分：
　　 (1)Integrinβ4在氣道上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激、損傷修復(fù)中的作用；
　　 (2)Integrinβ4在哮喘病人氣道黏膜的表達(dá)及與哮喘發(fā)病的相關(guān)性；
　　 (3)Integr

4、inβ4與臭氧應(yīng)激后AHR發(fā)病的相關(guān)性；
　　 (4)Integrinβ4對(duì)氣道上皮細(xì)胞抗原呈遞及淋巴細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)。
　　 方法與結(jié)果：
　　 1)Integrinβ4在氣道上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激及損傷修復(fù)中的作用體外培養(yǎng)的人支氣管上皮細(xì)胞株(16HBE14o-)及原代大鼠氣道上皮細(xì)胞(RTE)，分別用臭氧攻擊30 min，免疫組化及流式檢測(cè)顯示，臭氧應(yīng)激后，integrin p4在16HBE140-及RTE細(xì)胞上的

5、表達(dá)明顯上調(diào)。建立OVA應(yīng)激的大鼠哮喘模型，抗氧化能力檢測(cè)顯示活性氧自由基在OVA應(yīng)激后的大鼠氣道上皮細(xì)胞中含量明顯增加，免疫組化及realtime RT-PCR.結(jié)果顯示integrinβ4在OVA模型大鼠的氣道上皮表達(dá)下調(diào)，以上結(jié)果提示integrinβ4可能參與了氣道上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激過(guò)程。
　　 另外，我們觀察了integrinβ4在機(jī)械損傷后的氣道上皮細(xì)胞的表達(dá)，在生長(zhǎng)融合的16HBE14o-及RTE細(xì)胞培養(yǎng)板上機(jī)械刮

6、擦形成一個(gè)損傷區(qū)域，12h后免疫細(xì)胞化學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)在機(jī)械損傷邊緣的氣道上皮細(xì)胞呈現(xiàn)遷移趨勢(shì)，integrinβ4在損傷邊緣的上皮細(xì)胞表達(dá)顯著上調(diào)，提示integrinβ4可能參與了氣道上皮的損傷修復(fù)過(guò)程。
　　 為闡明integrinβ4在氣道上皮細(xì)胞損傷修復(fù)及氧化應(yīng)激過(guò)程中的作用，我們利用integrinβ4高表達(dá)載體和integrinβ4沉默載體建立integrinβ4在RTE細(xì)胞中的高表達(dá)和沉默細(xì)胞系，籍此觀察integri

7、nβ4在氣道上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激及損傷修復(fù)中的作用。損傷修復(fù)能力用損傷修復(fù)指數(shù)測(cè)定，增殖由MTT法測(cè)定?？寡趸芰叭N抗氧化酶的表達(dá)通過(guò)相應(yīng)的試劑盒檢測(cè)。結(jié)果顯示integrinβ4表達(dá)上調(diào)可明顯促進(jìn)RTE的損傷修復(fù)能力，其調(diào)節(jié)能力可能與上皮細(xì)胞的增殖能力相關(guān)。另外，integrinβ4的表達(dá)水平與RTE的抗氧化能力密切相關(guān)，其表達(dá)上調(diào)可增進(jìn)RTE的總抗氧化能力，進(jìn)一步結(jié)果提示integrinβ4對(duì)RTE抗氧化能力的調(diào)節(jié)與GSH-Px，S

8、OD，catalase三種抗氧化酶的表達(dá)水平相關(guān)。
　　 以上結(jié)果提示integrinβ4作為經(jīng)典的結(jié)構(gòu)性粘附分子在氣道上皮細(xì)胞組成性表達(dá)，其表達(dá)受各種刺激因素敏感調(diào)節(jié)。除結(jié)構(gòu)性粘附功能外，integrinβ4還參與到對(duì)氣道上皮細(xì)胞的損傷修復(fù)、抗氧化能力等過(guò)程的調(diào)節(jié)。在OVA應(yīng)激后的哮喘模型中，氣道上皮細(xì)胞integrinβ4表達(dá)明顯下調(diào)，進(jìn)而誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞損傷修復(fù)過(guò)程減慢，抗氧化能力降低，與OVA應(yīng)激后的哮喘表型緊密相關(guān)。因

9、此，我們推斷integrinβ4可能與哮喘、變應(yīng)性鼻炎等氣道上皮性疾病的發(fā)病相關(guān)。
　　 2)Integrinβ4在哮喘病人氣道黏膜的表達(dá)及其與哮喘發(fā)病的相關(guān)性本實(shí)驗(yàn)室在先前的研究中應(yīng)用基因芯片及生物信息學(xué)方法篩選了哮喘病人外周血差異表達(dá)的粘附分子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)integrinβ4基因在所有哮喘病人中表達(dá)均下調(diào)。Integrinβ4是一類經(jīng)典的結(jié)構(gòu)性粘附分子，它在氣道上皮細(xì)胞組成性表達(dá)維持氣道上皮的結(jié)構(gòu)及功能完整。哮喘病人氣道上皮表

10、現(xiàn)為明顯的結(jié)構(gòu)損傷及上皮脫落，提示可能存在粘附分子成員的表達(dá)缺陷。因此我們推測(cè)integrinβ4在哮喘病人的氣道黏膜可能存在差異表達(dá)并與哮喘發(fā)病相關(guān)。為探討integrinβ4在支氣管肺組織的分布表達(dá)及其與哮喘發(fā)病的相關(guān)性，這一部分工作我們觀察了integrinβ4在正常人及哮喘病人的氣道粘膜的表達(dá)。
　　 免疫組化結(jié)果顯示，在正常人的氣道黏膜，上皮結(jié)構(gòu)完整，上皮細(xì)胞排列整齊，integrinβ4組成性高表達(dá)。在哮喘病人的氣道

11、黏膜，上皮細(xì)胞出現(xiàn)結(jié)構(gòu)損傷，上皮細(xì)胞松動(dòng)脫落明顯，integrinβ4的膜內(nèi)及膜外蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。為進(jìn)一步研究哮喘病人氣道黏膜integrinβ4表達(dá)下調(diào)與哮喘發(fā)病的相關(guān)性。我們?cè)O(shè)計(jì)并篩選integrinβ4特異性siRNA(small interference)序列，進(jìn)一步構(gòu)建包裝為慢病毒載體，在16HBE14o-沉默integrinβ4基因后，觀察16HBE14o-在integrinβ4表達(dá)下調(diào)后粘附能力、損傷修復(fù)過(guò)程、細(xì)胞周期及

12、細(xì)胞凋亡的變化。結(jié)果顯示integrinβ4沉默后，16HBE14o-粘附率明顯減低，細(xì)胞增殖周期被抑制，大量細(xì)胞停留在G1期，S期細(xì)胞明顯減少，G2/G1減小，損傷修復(fù)速度減慢，細(xì)胞凋亡明顯增加。
　　 以上結(jié)果提示integrinβ4在哮喘病人氣道上皮細(xì)胞表達(dá)明顯下調(diào)，進(jìn)而誘發(fā)了氣道上皮細(xì)胞的粘附率降低，G1期阻止，損傷修復(fù)速度減慢，細(xì)胞活力降低，凋亡率增加，與哮喘病人氣道上皮細(xì)胞病理改變的臨床表型及發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。

13、>　　 3)Integrinβ4與臭氧應(yīng)激誘導(dǎo)的AHR(airway hyperresponsiveness，氣道)發(fā)病的相關(guān)性AHR是哮喘，變應(yīng)性鼻炎等呼吸系統(tǒng)疾病的主要臨床表現(xiàn)之一。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及離體實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)AHR的發(fā)病與氣道上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整及功能穩(wěn)態(tài)相關(guān)。本研究第二部分結(jié)果顯示，integrinβ4在哮喘病人的氣道黏膜表達(dá)特異性下調(diào)，誘導(dǎo)氣道上皮的增殖抑制，損傷修復(fù)減慢，與哮喘病人氣道上皮細(xì)胞的病理改變密切相關(guān)。我們推測(cè)

14、integrinβ4缺陷表達(dá)誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞功能失穩(wěn)態(tài)可能與AHR的誘發(fā)有關(guān)。
　　 為研究integrinβ4表達(dá)與AHR之間可能存在的內(nèi)在聯(lián)系，我們建立了臭氧攻擊不同時(shí)間誘導(dǎo)的AHR動(dòng)物模型。在臭氧攻擊不同時(shí)間點(diǎn)，分別檢測(cè)臭氧攻擊誘導(dǎo)的的氣道反應(yīng)性和integrinβ4的表達(dá)水平。RL(lung resisitence)由Buxco小動(dòng)物呼吸功能測(cè)量系統(tǒng)檢測(cè)，結(jié)果提示，臭氧攻擊后可誘發(fā)明顯的AHR，AHR程度伴隨臭氧攻擊時(shí)間的

15、增長(zhǎng)而更加明顯。臭氧攻擊結(jié)束后，AHR改變逐漸減弱回復(fù)正常。免疫組化及real time RT-PCR定量檢測(cè)integrinβ4表達(dá)水平，結(jié)果顯示臭氧攻擊后，integrinβ4蛋白及mRNA表達(dá)水平伴隨臭氧攻擊而逐漸下調(diào)，臭氧攻擊結(jié)束后，integrinβ4表達(dá)逐漸上升恢復(fù)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示臭氧攻擊AHR模型中，組胺激發(fā)后的RL水平與integrinβ4表達(dá)水平呈明顯負(fù)相關(guān)，提示臭氧攻擊后AHR的誘發(fā)可能與integrinβ4表達(dá)

16、密切相關(guān)。體外沉默integrinβ4在16HBE14o-的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)integrinβ4下調(diào)后16HBE14o-抗細(xì)胞氧化能力減弱，細(xì)胞凋亡明顯增加。
　　 以上結(jié)果提示，臭氧攻擊大鼠后誘發(fā)明顯AHR病變。Integrinβ4在臭氧攻擊后的大鼠氣道上皮表達(dá)明顯下調(diào)，進(jìn)而誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞抗氧化能力減弱，細(xì)胞凋亡增加，可能與臭氧攻擊后AHR發(fā)病相關(guān)。
　　 4)Integrinβ4對(duì)氣道上皮細(xì)胞抗原呈遞及淋巴細(xì)胞分化的

17、調(diào)控氣道上皮在抗原應(yīng)激后可識(shí)別抗原并進(jìn)行抗原呈遞，進(jìn)而誘導(dǎo)氣道局部的淋巴細(xì)胞增殖分化，故氣道上皮細(xì)胞的抗原呈遞過(guò)程與氣道局部的免疫炎癥反應(yīng)緊密相關(guān)。哮喘病人氣道黏膜局部表現(xiàn)為典型的Th2型淋巴細(xì)胞炎癥反應(yīng)，本研究第二部分結(jié)果顯示，integrinβ4在哮喘病人氣道上皮表達(dá)下調(diào)，且與哮喘病人氣道上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)功能失穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)。我們推測(cè)哮喘病人氣道上皮細(xì)胞integrinβ4表達(dá)下調(diào)可能參與對(duì)氣道上皮細(xì)胞抗原呈遞過(guò)程的調(diào)節(jié)，進(jìn)而與哮喘病人

18、氣道局部T淋巴細(xì)胞分化及Th2型炎癥表型相關(guān)。為驗(yàn)證以上假設(shè)，本研究觀察了integrinβ4下調(diào)對(duì)氣道上皮細(xì)胞的抗原呈遞能力及T淋巴細(xì)胞的增殖及分化的影響。
　　 免疫熒光實(shí)時(shí)定量觀察結(jié)果顯示integrinβ4沉默后氣道上皮細(xì)胞對(duì)外界抗原的識(shí)別及攝取能力明顯減慢；對(duì)照上皮細(xì)胞和integrinβ4沉默上皮細(xì)胞分別與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，用CFSE-DA標(biāo)記T淋巴細(xì)胞檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖，ELISA(enzyme linked imm

19、unosorbent assay)檢測(cè)共培養(yǎng)后細(xì)胞上清液中的細(xì)胞因子含量。結(jié)果顯示：與正常上皮細(xì)胞+淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)體系相比，與integrinβ4沉默氣道上皮細(xì)胞+T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)體系中T淋巴細(xì)胞活化增殖能力降低，共培養(yǎng)體系上清液中Th1型細(xì)胞因子IFN-gamma減少，Th1/Th2比值降低。
　　 以上結(jié)果提示integrinβ4在哮喘病人氣道黏膜的表達(dá)下調(diào)誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞抗原呈遞能力減弱，并抑制氣道黏膜局部T淋巴細(xì)胞Th1

20、性增殖分化，與哮喘病人氣道黏膜局部的Th2型炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 Integrinβ4在氣道上皮細(xì)胞組成性表達(dá)，其表達(dá)受各種外界刺激敏感調(diào)節(jié)。除結(jié)構(gòu)性粘附功能外，integrinβ4參與對(duì)氣道上皮細(xì)胞損傷修復(fù)、抗氧化等生理功能穩(wěn)態(tài)的維持與調(diào)節(jié)。Integrinβ4在哮喘病人氣道上皮及哮喘模型動(dòng)物氣道上皮表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致上皮結(jié)構(gòu)性損傷及功能失穩(wěn)態(tài)，誘導(dǎo)AHR，調(diào)控氣道局部的淋巴細(xì)胞向 Th2型炎癥反應(yīng)增殖分