Intelectin在哮喘氣道上皮細(xì)胞炎性細(xì)胞因子表達(dá)中的作用和機(jī)制.pdf

1、研究背景:
　　目前哮喘發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì),但是哮喘的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。哮喘是以氣道高反應(yīng)性、粘液分泌增多和慢性嗜酸性粒細(xì)胞炎癥為特點(diǎn)。有些報(bào)道已證實(shí)主要在哮喘患者氣道上皮細(xì)胞和單核細(xì)胞中,一些趨化因子RANTES,MCP-3,MCP-4,eotaxin-1andeotaxin-2等的mRNA表達(dá)是增加的。趨化因子是8-10kDa的小分子細(xì)胞因子,根據(jù)每個(gè)蛋白分子一個(gè)或兩個(gè)半胱氨酸殘基在N末端的位置可以分為四類,即,CXC,C

2、C,C,和CXXXC。許多CC類趨化因子是由氣道上皮細(xì)胞產(chǎn)生的。IL13可以誘導(dǎo)上皮細(xì)胞CCL11(eotaxin),CCL24(eotaxin-2),andCCL26(eotaxin-3)的表達(dá),且這些因子的表達(dá)在哮喘者是增加的。這些CC類趨化因子是嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞表面CCR受體的選擇性激動(dòng)劑。
　　哮喘是以TH2細(xì)胞調(diào)節(jié)為主,分泌的細(xì)胞因子與IL4/5/9/13,雖然都與哮喘相關(guān),但是IL13是現(xiàn)在認(rèn)為最關(guān)鍵的因子。白

3、介素13是由TH2型細(xì)胞分泌的分子量為12kDa多效能分子,位于常染色體5q31上。白介素13是富含嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞炎癥、粘液上皮化生、組織纖維化和基底重塑強(qiáng)有力的刺激劑。白介素13能夠刺激哮喘相關(guān)的許多細(xì)胞,例如B淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和氣道平滑肌細(xì)胞。一些實(shí)驗(yàn)也證明,重組白介素13的應(yīng)用或是肺中白介素13的過(guò)表達(dá)可以產(chǎn)生哮喘樣的氣道炎癥和氣道重塑。許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)白介素13在哮喘中是過(guò)

4、表達(dá)的,且與哮喘的特征TH2細(xì)胞炎癥和氣道重塑的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。因此,我們用IL13刺激氣道上皮細(xì)胞,模擬哮喘樣作用。
　　人intelectin(ITLN)是一種分泌性的糖蛋白,由295個(gè)氨基酸和N端寡糖組成,它的基本結(jié)構(gòu)單位是二硫鍵連接40kDa多肽成的120kDa的三聚體?？煞譃閕ntelectin-1和2。人intelectin也被稱作甘油磷酸肌醇連接的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、血管內(nèi)皮細(xì)胞凝集素或網(wǎng)膜素。人ITLN基因位于染色體1q2

5、1.3上,含有8個(gè)外顯子,且人intelectin的mRNA表達(dá)于心臟、小腸、結(jié)腸和胸腺。屬于凝集素類,能夠識(shí)別特定的細(xì)菌壁組分,而不被其他凝集素所識(shí)別。所熟知的是它在小腸的潘氏細(xì)胞和分泌或是杯狀細(xì)胞表達(dá)。最近,也觀察到在氣道上皮細(xì)胞分泌細(xì)胞也有表達(dá)?？梢宰R(shí)別存在于細(xì)菌、真菌和原蟲(chóng)壁上右旋戊糖和呋喃半乳糖殘基,但在哺乳動(dòng)物在不然,說(shuō)明intelectin在抗原識(shí)別中起重要作用。Intelectin-1在小鼠小腸暴露于線旋毛蟲(chóng)后,表達(dá)是上

6、調(diào)的,其同種型intelectin-2在小腸上皮細(xì)胞也被誘導(dǎo)。Intelectin-1是一個(gè)TH2細(xì)胞調(diào)節(jié)的抗菌蛋白,在哮喘患者支氣管上皮細(xì)胞中intelectin-1的基因表達(dá)水平是上調(diào)的,與IL13的表達(dá)上調(diào)相關(guān)。
　　第一部分，Intelectin-1在IL13誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞株A549和16HBE中炎性細(xì)胞因子表達(dá)中的作用
　　目的:探討intelectin-1基因在人肺泡/氣道上皮細(xì)胞分泌炎性因子中的作用。

7、>　　方法:實(shí)驗(yàn)用兩種細(xì)胞系A(chǔ)549和16HBE。分為轉(zhuǎn)染高表達(dá)質(zhì)粒分組為:(A)正常對(duì)照組(B)IL13組(C)轉(zhuǎn)染人ITLN1質(zhì)粒組;轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒分組:(A)正常對(duì)照組+空質(zhì)粒組(B)IL13+空質(zhì)粒組(C)IL13+Itln1-shRNA質(zhì)粒組。通過(guò)RealtimePCR方法檢測(cè)intelectin-1,CCL5和IL6mRNA的表達(dá)。ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞上清液中相應(yīng)因子的蛋白水平表達(dá)。地塞米松干預(yù)細(xì)胞:①對(duì)照組+DMSO②IL

8、13+DMSO③DEX100+IL13,然后通過(guò)RealtimePCR檢測(cè)細(xì)胞因子ITLN1,CCL5和IL6mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果:A549細(xì)胞中Intelectin-1,CCL5,IL6mRNA的表達(dá)水平,人ITLN1組和IL13組較對(duì)照組均明顯升高,p<0.05。而16HBE細(xì)胞Intelectin-1,CCL5,IL6mRNA的表達(dá)水平,人ITLN1組較對(duì)照組明顯增高,P<0.05均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;IL13組較對(duì)照組In

9、telectin-1,IL6mRNA表達(dá)水平增高,P<0.05;但是IL13組較對(duì)照組CCL5mRNA表達(dá)水平有增高趨勢(shì),但是未有統(tǒng)計(jì)意義。細(xì)胞A549和16HBE轉(zhuǎn)染人ITLN1-shRNA質(zhì)粒后,A549和16HBE細(xì)胞系:IL13+人ITLN1shRNA質(zhì)粒組較IL13組intelectin-1,CCL5和IL6的表達(dá)明顯下降,P<0.05,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ELISA方法檢測(cè)蛋白水平:高表達(dá)實(shí)驗(yàn),人ITLN質(zhì)粒組與對(duì)照組相比,IL

10、6,CCL5的蛋白表達(dá)水平明顯升高P<0.05。干擾實(shí)驗(yàn)組:IL13組較對(duì)照組,CCL5和IL6的蛋白表達(dá)水平明顯升高P<0.05;IL13+ITLN1-shRNA組較IL13組,CCL5和IL6的蛋白表達(dá)水平明顯降低P<0.05。在A549細(xì)胞,地塞米松+IL13組較IL13組,ITLN1,CCL5和IL6明顯減少的,P<0.05;在16HBE細(xì)胞,地塞米松組較IL13組,ITLN1,CCL5和IL6均有顯著下降,并p<0.05,均有

11、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:轉(zhuǎn)入人ITLN1高表達(dá)質(zhì)粒后,成功的促使細(xì)胞intelectin-1mRNA的高表達(dá)。一同檢測(cè)的因子CCL5和IL6的mRNA和蛋白表達(dá)水平也相應(yīng)的升高,可能與intelectin-1的表達(dá)升高有關(guān)。轉(zhuǎn)染人ITLN1干擾質(zhì)粒后,抑制了intelectin-1mRNA的表達(dá),一同檢測(cè)的因子CCL5和IL6的mRNA和蛋白表達(dá)水平也相應(yīng)的降低。Intelectin-1的表達(dá)可能抑制了CCL5和IL6的表達(dá)。糖皮

12、質(zhì)激素可以抑制A549和16HBE細(xì)胞中ITLN1,CCL5和IL6的基因表達(dá)。由此得出,Intelectin-1在IL-13誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞中炎性細(xì)胞因子CCL5和IL-6的表達(dá)中有重要的作用。
　　第二部分，ERK信號(hào)通路在intelectin-1介導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞炎性細(xì)胞因子CCL5和IL6表達(dá)中的作用
　　目的:研究探討intelectin-1參與氣道上皮細(xì)胞中炎性細(xì)胞因子CCL5和IL-6表達(dá)的機(jī)制。
　　

13、方法:用IL-13和PD98059分別干預(yù)人肺上皮細(xì)胞株A549和16HBE細(xì)胞。PD98059實(shí)驗(yàn)分組(1)對(duì)照組,(2)IL-13組,(3)IL-13+PD98059組。然后用RealTimePCR方法檢測(cè)細(xì)胞因子CCL5和IL6的mRNA的表達(dá)。轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒分組:(A)正常對(duì)照組+空質(zhì)粒組(B)IL13+空質(zhì)粒組(C)IL13+humanITLN1shRNA質(zhì)粒組,通過(guò)RNA干擾的方法抑制IL-13誘導(dǎo)的intelectin-1表

14、達(dá)后,用Western-Blot檢測(cè)intelectin-1,ERK1/2和P-ERK1/2蛋白水平的變化。
　　結(jié)果:用PD98059干預(yù)IL13刺激的A549和16HBE細(xì)胞后,CCL5和IL6的mRNA表達(dá)水平,IL13+PD98059組較IL13組明顯降低,P<0.05。轉(zhuǎn)染humanITLN1shRNA質(zhì)粒后,intelectin-1和P-ERK1/2蛋白表達(dá)水平,IL-13組較對(duì)照組升高,P<0.05;IL-13+sh

15、RNA組中intelectin-1和P-ERK1/2蛋白表達(dá)較IL-13組降低,P<0.05。
　　結(jié)論:ERK1/2的一種抑制劑PD98059,可以阻滯IL-13誘導(dǎo)的CCL5和IL6在A549和16HBE細(xì)胞中的表達(dá)。而且IL-13的刺激增加了ERK1/2磷酸化以及intelectin-1蛋白表達(dá),但HumanITLLN1-shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染抑制了IL-13誘導(dǎo)的intelectin-1蛋白表達(dá)及ERK1/2磷酸化。這些數(shù)據(jù)顯