塵螨特異性免疫治療減輕哮喘小鼠氧化應(yīng)激及氣道上皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、目的:目前很多實(shí)驗(yàn)研究表明氧化應(yīng)激以及細(xì)胞凋亡在哮喘發(fā)病的過程中起著重要的作用，而特異性免疫治療(Special ImmunologicTherapy, SIT)是治療哮喘的唯一根治性治療方法，因此本實(shí)驗(yàn)旨在探討塵螨特異性治療在減輕哮喘氣道細(xì)胞凋亡以及氣道氧化應(yīng)激中的作用以及其機(jī)制的研究。
　　方法:本實(shí)驗(yàn)分為動物部分和細(xì)胞部分。動物實(shí)驗(yàn):將32只6-8周齡Balb/C小鼠隨機(jī)分為正常對照組、哮喘模型組、SIT組、N-乙酰半胱氨酸

2、(N-acetylcysteine，NAC)組。哮喘組、SIT組、NAC組用塵螨粗提液進(jìn)行致敏，SIT組和NAC組在小鼠滴鼻激發(fā)之前進(jìn)行治療干預(yù)。對照組的操作給予PBS處理。激發(fā)后24h內(nèi)進(jìn)行氣道高反應(yīng)性檢測，之后將小鼠處死并采集標(biāo)本。行肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中ROS(Reative Oxygen Species)以及細(xì)胞因子的檢測，肺組織HE染色(Hematoxylin-eos

3、in staining),PAS染色(Periodic Acid-Schiff, PAS),TUNEL凋亡實(shí)驗(yàn)。肺組織冰凍切片檢測活性氧ROS，肺組織勻漿檢測細(xì)胞因子以及MDA，流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry，F(xiàn)CM)檢測Treg細(xì)胞(RegulatoryT Cells)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn):分為對照組，IL-25低濃度組， IL-25高濃度組，將重組人IL-25加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中刺激細(xì)胞，分別在12h和24h收集細(xì)胞行細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)Ann

4、exin V-PI(AV-PI)以及流式檢測ROS實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)果:1.動物實(shí)驗(yàn):(1)氣道高反應(yīng)性的檢測:哮喘模型組中的小鼠氣道反應(yīng)性較于正常組小鼠有明顯的增高，而SIT組和NAC組小鼠氣道反應(yīng)性較哮喘組中小鼠有所減輕。(2)肺泡灌洗液炎癥細(xì)胞計數(shù):SIT組和NAC組炎癥細(xì)胞總數(shù)以及少于哮喘組，其中嗜酸性粒細(xì)胞比例小于哮喘組。(3) HE染色:SIT組和NAC組小鼠肺組織中炎性細(xì)胞浸潤較哮喘組小鼠有明顯減輕。(4)PAS染色:S

5、IT組和NAC組小鼠氣道粘液分泌較哮喘小鼠有所減輕。(5)TUNEL染色:SIT組和NAC組小鼠肺組織以及氣道細(xì)胞凋亡細(xì)胞明顯較哮喘組小鼠有所減少。(6) sIgG1，sIgE以及細(xì)胞因子ELISA:塵螨特異性免疫治療則明顯降低了sIgG1，sIgE，IL-4，IL-5，IL-13，IL-25的含量。(7) MDA(丙二醛)檢測:哮喘小鼠肺組織MDA含量明顯升高，而塵螨特異性免疫治療和NAC組明顯降低肺組織中脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA的含量。(

6、8)肺泡灌洗液ROS檢測:哮喘組小鼠肺泡灌洗液細(xì)胞中ROS明顯增多，而SIT組以及NAC組明顯減少了BALF中的ROS生成(9)流式檢測Treg細(xì)胞:SIT治療的哮喘小鼠Treg細(xì)胞數(shù)量相較于正常PBS組和哮喘模型組小鼠有顯著的增多。第二部分:細(xì)胞實(shí)驗(yàn):(1) Annexin V-PI(AV-PI)凋亡細(xì)胞檢測:IL-25可以明顯上調(diào)16HBE人氣道上皮細(xì)胞的凋亡。(2)流式檢測ROS:IL-25能夠刺激16HBE人氣道上皮細(xì)胞ROS的

7、生成。
　　結(jié)論:第一部分動物實(shí)驗(yàn):1塵螨特異性免疫治療可以減輕哮喘小鼠氣道高反應(yīng)哮喘癥狀，降低sIgE水平，并可能通過下調(diào)Treg細(xì)胞減輕哮喘小鼠肺組織的炎癥浸潤。2.塵螨特異性免疫治療可以下調(diào)一系列炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，可以下調(diào)IL-25的表達(dá)。3.塵螨特異性免疫治療可以減輕哮喘小鼠肺組織氧化應(yīng)激以及肺組織細(xì)胞的凋亡。第二部分:細(xì)胞實(shí)驗(yàn):1.IL-25細(xì)胞因子可以誘發(fā)HBE細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)。2.IL-25細(xì)胞因子可以誘導(dǎo)16H