GSK3在吸煙致氣道上皮和肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞損傷修復(fù)中的作用研究.pdf

1、第一部分 糖原合成酶激酶3在吸煙誘導(dǎo)的豬氣道上皮細(xì)胞鱗狀分化中的作用研究 氣道(氣管和支氣管)上皮的鱗狀細(xì)胞化生常見于慢性支氣管炎癥、致癌劑刺激(如吸煙)等，一般被認(rèn)為是對(duì)慢性損傷的一種適應(yīng)性反應(yīng)，也是肺鱗癌的癌前病變，其分子機(jī)制尚未完全闡明。糖原合成酶激酶3(glycogensynthasekinase3，GSK3)是一種多功能的蛋白激酶，有結(jié)構(gòu)和功能相似的兩種亞型GSK3α和GSK3β，在靜息細(xì)胞內(nèi)呈組成性激活，其N

2、末端絲氨酸殘基(Ser21-GSK3α，Ser9-GSK3β)的磷酸化可導(dǎo)致其活性抑制[1]。多年來大量的研究表明，GSK3具有廣泛的底物，包括代謝酶、翻譯起始因子、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞周期相關(guān)蛋白、癌基因產(chǎn)物和細(xì)胞骨架蛋白等，可參與糖代謝、蛋白質(zhì)合成以及細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和運(yùn)動(dòng)等多種生命活動(dòng)。近來研究顯示GSK3及其轉(zhuǎn)錄因子底物AP-1(activatorprotein-1)可能參與氣道上皮鱗狀分化的發(fā)生。因此，本研究對(duì)GSK3的表達(dá)、

3、GSK3和AP-1信號(hào)在吸煙誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞鱗狀分化中的作用進(jìn)行了初步探討。 轉(zhuǎn)錄因子活性檢測顯示香煙煙霧提取物和尼古丁處理可顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子AP-1與外皮蛋白基因上游調(diào)節(jié)區(qū)域的結(jié)合活性；而用GSK3的抑制劑LiCl和SB216763模擬香煙成分的作用也得到了類似的結(jié)果，提示GSK3可能通過負(fù)向調(diào)節(jié)AP-1的活性從而介導(dǎo)了香煙成分誘導(dǎo)的豬氣道上皮鱗狀分化。 小結(jié) 上述結(jié)果表明：(1)香煙成分可抑制豬氣道上皮細(xì)胞

4、的增殖并誘導(dǎo)其發(fā)生鱗狀分化。(2)GSK3在氣道上皮細(xì)胞中有豐富的表達(dá)，可能通過負(fù)向調(diào)節(jié)AP-1的活性從而介導(dǎo)了香煙成分誘導(dǎo)的豬氣道上皮鱗狀分化。 第二部分 吸煙致肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞損傷中GSK3β的活性變化對(duì)β-catenin/TCF信號(hào)途徑的影響 大量研究證明，吸煙能夠從多個(gè)方面損傷肺泡上皮細(xì)胞，阻礙其遷移、增生和分化以修復(fù)受損區(qū)域，因而有助于吸煙相關(guān)疾病(如慢性阻塞性肺疾病和支氣管源性肺癌等)的發(fā)生與發(fā)展。然而

5、，吸煙致肺泡上皮細(xì)胞損傷的分子機(jī)制還遠(yuǎn)未闡明。 β-連環(huán)素(β-catenin)是一種多功能蛋白，既可作為細(xì)胞骨架蛋白與E-鈣粘附素結(jié)合，參與組成中間連接，維持上皮細(xì)胞的極性和組織結(jié)構(gòu)的完整性；又是Wnt信號(hào)途徑的重要成員，可與TCF/LEF(Tcellfactor/lymphoidenhancerfactor)結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體，調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)，參與細(xì)胞和組織的發(fā)育分化、損傷修復(fù)以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等生物學(xué)過程。最近研究

6、顯示，尼古丁和香煙致癌物NNK可促進(jìn)糖原合成酶激酶3(glycogensynthasekinase3，GSK3)的抑制性磷酸化，而GSK3β可磷酸化調(diào)節(jié)β-catenin，在經(jīng)典的Wnt信號(hào)途徑中起關(guān)鍵性抑制作用。 為進(jìn)一步分析GSK3β是否在其中發(fā)揮了作用，用持續(xù)激活突變型GSK3β(GSK3βS9A，不受GSK3的上游激酶下調(diào)而持續(xù)激活)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后檢測GSK3β和β-catenin的水平，結(jié)果顯示GSK3β的表達(dá)明顯增強(qiáng)，而

7、β-catenin的表達(dá)則顯著降低，證實(shí)了肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞中GSK3β的表達(dá)和活性增強(qiáng)可促進(jìn)β-catenin的降解；與此同時(shí)，也證明所用質(zhì)粒GSK3βS9A是可靠的。然后，將GSK3βS9A與pGL3-OT共轉(zhuǎn)染后，再加入CSE處理，進(jìn)行熒光報(bào)告基因分析。分析發(fā)現(xiàn)，與僅用CSE處理組相比，共轉(zhuǎn)染GSK3βS9A組的熒光素酶活性顯著降低，差異有極顯著意義(P＜0.01)，說明細(xì)胞轉(zhuǎn)染GSK3βS9A后表達(dá)的突變型GSK3β不受CSE的抑

8、制而持續(xù)激活，促進(jìn)了β-catenin的降解，因而導(dǎo)致β-catenin/TCF信號(hào)的抑制。上述結(jié)果表明，在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞中，CSE可通過抑制GSK3β而增強(qiáng)β-catenin/TCF的轉(zhuǎn)錄活性。 小結(jié) 本實(shí)驗(yàn)表明：(1)CSE可抑制肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞中GSK3β的表達(dá)和活性。(2)CSE可促進(jìn)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)和轉(zhuǎn)位從而激活β-catenin/TCF信號(hào)。(3)在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞中，CSE可通過