腸道上皮細(xì)胞來(lái)源的exosome在腸道免疫平衡維持中的功能及其機(jī)制研究.pdf

1、腸道是人體最大的免疫耐受器官，對(duì)大量的食物抗原和腸道菌群進(jìn)行耐受。然而，腸道免疫耐受的潛在機(jī)制至今仍然不是很清楚。一系列因素的相互作用形成了一個(gè)精細(xì)復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，調(diào)節(jié)腸道的免疫穩(wěn)態(tài)，這些因素包括調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cell，Treg)、 DC、 CD8+T細(xì)胞、γδ T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性B細(xì)胞、IgA、腸道共生菌群和大量細(xì)胞因子如TGF-β1和IL-10。而一旦腸道免疫耐受被打破，就會(huì)導(dǎo)致腸道的自身免疫性疾病，如IBD。

2、IBD是一種最常見(jiàn)的腸道免疫失衡性疾病之一。炎癥性腸病(IBD)又稱腸炎，是一組腸道炎癥性疾病的統(tǒng)稱。炎癥性腸病的主要分為克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎兩類(lèi)。由于其具有反復(fù)發(fā)作的特性，IBD病人的病情控制并不樂(lè)觀，所以深入探討腸道免疫耐受對(duì)于研究治療IBD的新策略具有重要意義。
　　Exosome是由活細(xì)胞分泌的、具有直至雙分子層、大小在50-100nm之間的生物活性小囊泡。它們是由胞內(nèi)的多囊泡體出芽、融合，再向胞外釋放。如今已有多項(xiàng)研究

3、證實(shí)，exosome在免疫系統(tǒng)中扮演著多重角色，它既能抑制免疫反應(yīng)、又能正向促進(jìn)免疫反應(yīng)的發(fā)生。已經(jīng)知道，腸道上皮細(xì)胞能夠分泌MHC-Ⅱ+A33+exosome，而且在給大鼠喂食特定的抗原之后，其血清中會(huì)短暫地出現(xiàn)類(lèi)似exosome的囊泡，人們將其命名為tolerosome。本課題旨在探究來(lái)自小鼠腸道的exosome是否參與了腸道免疫耐受的維持，同時(shí)以exosome為視角來(lái)解釋腸道免疫耐受的機(jī)制。
　　首先將從腸道獲取的exoso

4、me進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明來(lái)自小腸的exosome(Exosomes from Small Intestine，Si-EXO)和大腸來(lái)源的exosome(Li-EXO)都是MHC-Ⅱ、 CD11c和A33陽(yáng)性的，說(shuō)明腸道exosome主要是由腸道樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)和腸道上皮細(xì)胞(IEC)分泌的。為了進(jìn)一步對(duì)提取的exosome進(jìn)行鑒定，采用了蔗糖密度梯度離心法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，HSP70和A33這兩個(gè)蛋白質(zhì)集中在1.09-1.17g/ml

5、之間，提示exosome的密度在1.09-1.17g/ml之間。這兩種exosome都高表達(dá)TGF-β1，暗示其具有免疫抑制效應(yīng)。接下來(lái)在體外檢測(cè)了其免疫抑制的功能，結(jié)果表明這兩種exosome在體外都能夠抑制CD4+T細(xì)胞的增殖，而且是濃度梯度依賴的。為了區(qū)分具體是DC還是IEC來(lái)源的exosome發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)，用CD11c+磁珠分選出CD11c+和CD11c-Li-EXO，并對(duì)這兩群exosome進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示腸道上皮細(xì)胞來(lái)

6、源的Li-EXO發(fā)揮了免疫抑制效應(yīng)。為了證實(shí)TGF-β1在A33+ Li-EXO的免疫抑制效應(yīng)中發(fā)揮的作用，預(yù)先用一種強(qiáng)效的、具有選擇性的TGF-β受體Ⅰ抑制劑SB525334處理CD4+T細(xì)胞，然后再和A33+Li-EXO進(jìn)行孵育。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在阻斷了TGF-β1信號(hào)通路之后，A33+ Li-EXO對(duì)CD4+T細(xì)胞的增殖抑制效果完全消除了，由此說(shuō)明A33+ Li-EXO通過(guò)TGF-β1信號(hào)抑制CD4+T細(xì)胞的增殖。
　　采用D

7、SS誘導(dǎo)小鼠炎癥性腸?。↖BD）模型，研究分離出來(lái)的腸道exosome是否在體內(nèi)參與腸道免疫耐受。在給小鼠回輸A33+Li-EXO之后，觀察到隨著回輸A33+ Li-EXO的濃度增加，小鼠體重減輕的趨勢(shì)得到了緩解。A33+ Li-EXO在體內(nèi)和體外都能夠誘導(dǎo)CD4+Foxp3+ Treg的分化。為了明確A33+Li-EXO在體內(nèi)通過(guò)誘導(dǎo)了CD4+Foxp3+Treg而發(fā)揮緩解小鼠IBD，用Anti-CD25小鼠單抗在體內(nèi)部分敲除CD4+

8、Foxp3+ Treg，結(jié)果顯示A33+Li-EXO緩解IBD的效果減弱了，說(shuō)明Treg參與了A33+Li-EXO緩解IBD的過(guò)程。此外，來(lái)自IBD小鼠的Li-EXO(IBD-Li-EXO)比健康小鼠的 Li-EXO(Ctrl-Li-EXO)含有更高水平的TGF-β1。因此，無(wú)論在體內(nèi)還是體外，IBD-Li-EXO免疫抑制功能和緩解IBD方面都比Ctrl-Li-EXO更強(qiáng)。此外，還發(fā)現(xiàn)A33+Li-EXO能夠顯著地抑制LPS刺激DC后I

9、L-12的分泌水平，同時(shí)在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中抑制了T細(xì)胞的增殖，采用了DC功能缺陷的CD11 c-DTR小鼠建立IBD模型，經(jīng)A33+ Li-EXO處理后，注射白喉毒素的CD11 c-DTR小鼠經(jīng)DSS誘導(dǎo)IBD后，其體重減輕的程度明顯比野生型的小鼠更高，更好地說(shuō)明了A33+Li-EXO通過(guò)調(diào)節(jié)DC的功能緩解了小鼠IBD。
　　而用中性鞘磷脂酶抑制劑Spiroepoxide在體內(nèi)抑制exosome的分泌之后，小鼠IBD癥狀加重，在

10、經(jīng)過(guò)spiroepoxide處理的DSS誘導(dǎo)IBD小鼠上回輸外源性Li-EXO后，spiroepoxide增強(qiáng)小鼠對(duì)DSS誘導(dǎo)的IBD的易感性的效應(yīng)消失了。結(jié)果表明，Spiroepoxide能夠抑制小鼠腸道exosome的分泌，因而增強(qiáng)了小鼠對(duì)DSS誘導(dǎo)的IBD的易感性。此外，有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)，A33+ Li-EXO特異性地定居于腸道中，說(shuō)明這群exosome只在腸道局部發(fā)揮作用。除了Li-EXO，其他幾種器官來(lái)源的exosome都不

11、表達(dá)A33，而且將外源性A33+ Li-EXO回輸?shù)襟w內(nèi)后大部分都停留在胃、小腸、大腸和腸系膜淋巴結(jié)等胃腸道組織中，這些結(jié)果表明A33+Li-EXO具有器官特異性，在胃腸道局部發(fā)揮作用。
　　在本課題中發(fā)現(xiàn)腸道上皮細(xì)胞分泌了具有免疫抑制效果的exosome，這些exosome能夠緩解DSS誘導(dǎo)的小鼠IBD，這些結(jié)果意味著腸道exosome參與了腸道免疫耐受的維持。研究結(jié)果為解釋腸道免疫耐受提供了一種新的機(jī)制，同時(shí)，也提示增加腸道e