丁酸梭菌與腸道上皮細胞互作的分子機制的研究.pdf

1、丁酸梭菌作為益生菌已被廣泛的應(yīng)用于治療腸炎、改善動物的生產(chǎn)性能等方面，并得到了普遍的認可。但是寄主細胞識別丁酸梭菌并由此產(chǎn)生的益生作用的分子機制尚不明確。本論文旨在探討丁酸梭菌的益生機制。
　　 試驗一:用丁酸梭菌刺激HT-29細胞，然后通過測定跨膜受體TLRs（toll-like receptor）和炎性因子的表達分析丁酸梭菌誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑。試驗結(jié)果顯示，丁酸梭菌能夠顯著提高TLR2 mRNA的表達水平，但卻沒有影響TLR

2、2、TLR4、TLR5、TLR9、MyD88(myeloiddifferentiation primary response protein88)的表達。同時發(fā)現(xiàn)，NF-κB、IL-8、TNF-α的表達量亦顯著提高，說明HT-29細胞被誘導(dǎo)發(fā)生了免疫反應(yīng)。但是與大腸桿菌相比，丁酸梭菌誘導(dǎo)的NF-κB(nuclear factorκB)、IL-8（interleukin-8）、TNF-α(tumor necrosis factoralph

3、a)的表達水平卻低很多。另外，丁酸梭菌能夠顯著提高炎性抑制因子IL-10和Hsp70(heat shock protein70)的表達量，這可能和丁酸梭菌的益生特性有關(guān)。
　　 試驗二:分別使用TLR2和MyD88特異性siRNA（small interfering RNA）敲除HT-29細胞TLR2和MyD88基因。沉默MyD88基因?qū)Χ∷崴缶T導(dǎo)的NF-κB、IL-8、IL-6、TNF-α的表達沒有影響，但是沉默TLR2基因

4、卻使NF-κB、IL-8、IL-6、TNF-α的表達下降，說明TLR2是丁酸梭菌的特異性受體。因此，丁酸梭菌可激活由TLR2介導(dǎo)的MyD88-非依賴性信號傳導(dǎo)通路。
　　 試驗三:TLR2是識別丁酸梭菌的關(guān)鍵性受體，我們進一步分析了TLR2的結(jié)構(gòu)和活性區(qū)域。首先，以鼠的TLR2晶體結(jié)構(gòu)為模板，通過同源模建方法構(gòu)建了人的TLR2的三維結(jié)構(gòu)，然后采用分子對接技術(shù)模建了人的TLR2與脂磷壁酸(LTA)的相互作用模型，發(fā)現(xiàn)了TLR2受體

5、識別LTA的關(guān)鍵性殘基，這對進一步開展定點突變試驗具有指導(dǎo)意義。
　　 試驗四:用IL-10特異性siRNA(siIL-10)和IL-10抗體處理HT-29細胞，用以敲除和中和IL-10。試驗結(jié)果顯示，中和或敲除IL-10促進了丁酸梭菌誘導(dǎo)的NF-κB的活化和IL-8的表達。另外發(fā)現(xiàn)IL-10被中和和敲除后，丁酸梭菌能夠誘導(dǎo)HT-29細胞發(fā)生嚴(yán)重的凋亡和壞死。試驗結(jié)果說明，IL-10在腸道寄主細胞識別丁酸梭菌以及丁酸梭菌調(diào)節(jié)的免

6、疫保護方面發(fā)揮著重要作用。
　　 試驗五:首先，測定丁酸梭菌及其SCS對EHEC（大腸桿菌）的生長、粘附的抑制作用;結(jié)果顯示，丁酸梭菌及其SCS有顯著抑制效果。另一方面，丁酸梭菌和其SCS能夠抑制EHEC引發(fā)的CEICs（雞胚腸道細胞）凋亡。同時發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌可通過調(diào)節(jié)XIAP（X連鎖凋亡抑制蛋白）、BclXL(B-cell lymphoma-extra large)、FAS、Bcl2(B-cellleukaemia/lymph

7、oma-2)、BAX(Bcl2-associated X protein)、P53(Tumor protein53)的表達和抑制caspase（半胱氨酸蛋白酶）-9、caspase-3的活力緩解EHEC誘導(dǎo)的細胞凋亡。試驗結(jié)果表明，丁酸梭菌既可直接的抑制EHEC的活力，又可間接通過調(diào)節(jié)凋亡因子的表達抑制EHEC誘導(dǎo)的細胞凋亡，從而發(fā)揮對EHEC誘導(dǎo)的腸道炎癥的抑制作用;這有助于揭示丁酸梭菌的益生機理。此外，我們首次選用CEICs作為體外