肺臟來(lái)源的exosome參與肺臟免疫平衡維持的功能及其機(jī)制研究.pdf

1、人體每天經(jīng)呼吸道吸入大量外界環(huán)境中的抗原性物質(zhì)，而進(jìn)入呼吸道系統(tǒng)中的各種外界環(huán)境抗原均有可能誘發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生強(qiáng)烈的排異反應(yīng)。然而正常情況下，呼吸道卻始終能夠處于一種相對(duì)的免疫平衡狀態(tài)，說(shuō)明肺臟可以通過(guò)某些精細(xì)調(diào)節(jié)誘導(dǎo)對(duì)外來(lái)抗原的免疫耐受，從而維持肺臟的相對(duì)免疫平衡狀態(tài)。隨著人類(lèi)長(zhǎng)期的進(jìn)化，我們的免疫系統(tǒng)逐漸形成了幾種有效的方式維持機(jī)體對(duì)一些外來(lái)無(wú)害抗原的免疫耐受，包括克隆失能、克隆忽略和通過(guò)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分泌IL-10及TGF-β1等

2、抑制性細(xì)胞因子防止免疫效應(yīng)細(xì)胞的活化等。而一旦肺臟免疫耐受平衡被打破會(huì)導(dǎo)致呼吸道相關(guān)的自身免疫性疾病，比如哮喘。哮喘是最常見(jiàn)的呼吸道免疫失衡性疾病之一，目前認(rèn)為T(mén)h1/Th2細(xì)胞之間平衡的紊亂是哮喘最主要的發(fā)病機(jī)制，免疫失衡是哮喘重要的發(fā)病基礎(chǔ)，而對(duì)呼吸道免疫耐受形成機(jī)制的深入研究也可以為哮喘的治療提供新的思路。
　　Exosome是各種活細(xì)胞分泌的具有脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)的小囊泡，其直徑主要介于30-100nm之間，密度范圍從1.1

3、2g/ml到1.21g/ml。目前已經(jīng)有很多文獻(xiàn)證實(shí)，exosome在促進(jìn)免疫反應(yīng)和抑制免疫反應(yīng)中扮演著重要作用，本課題中exosome的來(lái)源為小鼠肺臟組織，我們探討肺臟組織來(lái)源的exosome是否參與了肺臟免疫耐受的維持，通過(guò)建立哮喘動(dòng)物模型來(lái)驗(yàn)證我們的這一猜想，從而為呼吸道免疫耐受失衡相關(guān)疾病提供新的思路。
　　首先我們對(duì)肺臟來(lái)源的exosome(exosome from lung，L-EXO)進(jìn)行鑒定，電鏡結(jié)果表明我們提取的

4、L-EXO直徑一般在30-100nm之間，通過(guò)密度梯度離心密度范圍為1.09g/ml到1.17g/ml之間，且表達(dá)CD63、TSG101和HSP70等exosome標(biāo)志性蛋白，而不表達(dá)質(zhì)膜相關(guān)蛋白GRP94。此外，L-EXO還表達(dá)免疫抑制分子TGF-β1和IL-10。我們發(fā)現(xiàn)L-EXO能在體外明顯抑制CD4+T細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)Treg的產(chǎn)生，采用TGF-β1受體阻斷我們發(fā)現(xiàn)L-EXO對(duì)CD4+T細(xì)胞增殖抑制的能力幾乎消失了，說(shuō)明L-E

5、XO具有免疫抑制功能依賴(lài)于TGF-β1。接著，我們探討了L-EXO的具體來(lái)源細(xì)胞。L-EXO表面表達(dá)CD8、CD11c和SPB(surfactantprotein B)，采用磁珠分選的方法分選出CD11c陽(yáng)性和CD8陽(yáng)性的L-EXO，我們發(fā)現(xiàn)分選的CD11c陽(yáng)性的L-EXO同時(shí)表達(dá)CD8;反之亦然。而且只有該群L-EXO具有抑制CD4+T細(xì)胞的增殖的能力，說(shuō)明具有免疫抑制功能的L-EXO是來(lái)源于CD8陽(yáng)性的樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic

6、 cells，DCs)。
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分我們采用OVA誘導(dǎo)的小鼠急性哮喘模型，探討我們分離出來(lái)的L-EXO是否參與肺臟免疫耐受的維持，通過(guò)尾靜脈回輸L-EXO后分析肺泡灌洗液的細(xì)胞成分、各種細(xì)胞因子和肺臟病理變化，我們發(fā)現(xiàn)L-EXO對(duì)哮喘癥狀有一定的緩解效應(yīng)，根據(jù)之前的分選L-EXO亞群的結(jié)果我們分選出CD11c+L-EXO回輸小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)對(duì)哮喘的緩解效果更好，所以體內(nèi)體外結(jié)果均提示我們L-EXO對(duì)哮喘的癥狀有一定程度的緩解。接

7、下來(lái)我們想知道L-EXO對(duì)哮喘的緩解作用是否依賴(lài)于TGF-β1。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明回輸正常小鼠L-EXO后，Smad3+/-小鼠哮喘緩解效果較對(duì)照野生型C57小鼠差，但L-EXO對(duì)Smad3+/-小鼠的哮喘仍具有一定的緩解作用。鑒于，我們?cè)贚-EXO中同時(shí)還發(fā)現(xiàn)較高水平的IL-10。因此，我們進(jìn)一步評(píng)價(jià)L-EXO攜帶的IL-10是否參與其對(duì)小鼠哮喘的緩解作用。我們分選了IL-10-/-小鼠的L-EXO回輸給C57小鼠，雖然具有緩解哮喘的效

8、果，但與正常小鼠來(lái)源的L-EXO相比，其作用要明顯削弱，這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提示L-EXO依賴(lài)于TGF-β1和IL-10維持呼吸道的免疫耐受。
　　為進(jìn)一步明確L-EXO在維持呼吸道免疫耐受中的作用，我們采用中性鞘磷脂酶小干擾RNA敲低3LL肺癌細(xì)胞中Smpd3的表達(dá)，并證實(shí)了當(dāng)Smpd3的表達(dá)被被抑制之后，可明顯抑制exosome的分泌。之后，體內(nèi)也驗(yàn)證了當(dāng)給予小鼠鼻飼滴入Smpd3干擾慢病毒后小鼠肺臟分泌exosome的量減少，同時(shí)我

9、們可以觀察到，OVA誘導(dǎo)的小鼠急性哮喘癥狀明顯加強(qiáng)，而外源性回輸L-EXO后小鼠的哮喘癥狀可以得到緩解，表明L-EXO參與了呼吸道免疫耐受的維持。
　　綜上，在本課題的研究中，我們發(fā)現(xiàn)L-EXO具有免疫抑制功能，能夠通過(guò)其攜帶的TGF-β11和IL-10緩解OVA誘導(dǎo)的小鼠急性哮喘，而生理存在的L-EXO對(duì)老鼠哮喘的癥狀具有重要的影響。我們的研究結(jié)果為解釋肺臟免疫耐受提供了一種新的機(jī)制，同時(shí)也提示我們可以通過(guò)增加L-EXO的分泌治