小劑量內(nèi)毒素對(duì)腸道上皮細(xì)胞天然屏障功能及TLR2,4表達(dá)的影響.pdf

1、目的:
　　以致病性大腸桿菌和雙歧桿菌來源的內(nèi)毒素作用于大鼠腸道正常上皮細(xì)胞IEC18后,觀察不同細(xì)菌來源的內(nèi)毒素對(duì)上皮細(xì)胞Toll樣受體2和4表達(dá)的影響,以及跨膜細(xì)胞電阻的改變,探討致病菌和雙歧桿菌這兩類不同腸道共生菌來源的小劑量內(nèi)毒素誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞發(fā)揮免疫防御功能的機(jī)制。
　　方法:
　　將致病性大腸桿菌內(nèi)毒素O127:B8加入細(xì)胞中,分別是0.5mg/ml,1mg/ml,5mg/ml3種不同濃度。幼兒雙歧桿菌、長

2、雙歧桿菌、兩雙歧桿菌、青春雙歧桿菌上清液分別稀釋100倍,300倍加入細(xì)胞中。在干預(yù)4小時(shí),8小時(shí),12小時(shí),16小時(shí)后采用熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)檢測上皮細(xì)胞干預(yù)后TLR2,4mRNA表達(dá)情況,找出最佳干預(yù)濃度及時(shí)間點(diǎn)后,實(shí)驗(yàn)分為六組:空白對(duì)照組、EPEC(O127:B8)組、幼兒雙歧桿菌組、長雙歧桿菌組、兩雙歧桿菌組、青春雙歧桿菌組。Westernblot檢測各實(shí)驗(yàn)組IEC18后細(xì)胞的TLR2,4蛋白的表達(dá)改變。

3、上皮細(xì)胞跨膜電阻儀(EVOM)測量六組細(xì)胞在30分鐘,60分鐘,90分鐘,120分鐘的跨膜細(xì)胞電阻的改變。
　　結(jié)果:
　　根據(jù)qRT-PCR檢查的不同干預(yù)條件下IEC18細(xì)胞的最佳時(shí)間為干預(yù)16小時(shí),EPEC內(nèi)毒素濃度為5mg/ml,四種雙歧桿菌稀釋300倍為有效濃度。在干預(yù)16小時(shí)后,EPEC組與對(duì)照組相比TLR2mRNA和TLR4mRNA的表達(dá)增加了7.46±1.227和13.77±1.27倍(P值均<0.001)。幼

4、兒雙歧桿菌組、長雙歧桿菌組和青春雙歧桿菌組的IEC18細(xì)胞與空白組相比TLR2mRNA的表達(dá)降低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。幼兒雙歧桿菌組0.39±0.12、長雙歧桿菌組0.47±0.43和青春雙歧桿菌組0.47±0.25,這三組雙歧桿菌組間TLR2mRNA的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩雙歧桿菌組(0.55±0.27)TLR2mRNA的表達(dá)降低無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩雙歧桿菌組(0.41±0.34)和青春雙歧

5、桿菌組(0.46±0.37)與空白對(duì)照組相比TLR4mRNA的表達(dá)降低(P值均<0.05)。而幼兒雙歧桿菌(0.66±0.20)和長雙歧桿菌(0.59±0.11)TLR4mRNA的表達(dá)降低無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。這四種雙歧桿菌組間TLR4mRNA的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P值均>0.05)。上述各實(shí)驗(yàn)組TLR2,4mRNA表達(dá)趨勢的改變與westernblot檢測各實(shí)驗(yàn)組干預(yù)后TLR2,4蛋白表達(dá)的改變一致。IEC18的跨膜細(xì)胞電阻

6、值下降。幼兒雙歧桿菌組、長雙歧桿菌組、兩雙歧桿菌組、青春雙歧桿菌組跨膜細(xì)胞電阻值分別下降了19％,18%,23%,23%。與空白組及四組雙歧桿菌組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。EPEC組跨膜細(xì)胞電阻下降了67%,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　腸道上皮細(xì)胞是腸道粘膜免疫系統(tǒng)重要組成部分,正常腸道上皮細(xì)胞表達(dá)少量的TLR2和TLR4,防止有害病菌的入侵以及維持腸道眾多共生菌穩(wěn)定中起到重要作用。小劑量的致病性大