CD38對巨噬細(xì)胞TLR2基因表達及功能的影響.pdf

1、背景與目的:炎癥是機體組織對損傷因子的一種防御性反應(yīng)。炎癥反應(yīng)參與了肥胖、動脈粥樣硬化等多種代謝性疾病和心血管疾病的病理進程,TLR家族基因在炎癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用,巨噬細(xì)胞及中性粒炎性細(xì)胞的浸潤,伴隨著大量炎性因子的分泌,從而促使泡沫細(xì)胞生成等過程與之密切相關(guān)。CD38具有雙功能酶活性,即ADPR(ADP-ribosyl)環(huán)化酶和水解酶活性。它可以將NAD+催生成cADPR,同時可以將cADPR降解成ADPR,其發(fā)揮酶活性區(qū)域

2、為胞外結(jié)構(gòu)域。我們的前期結(jié)果顯示,CD38基因缺失可明顯增強小鼠巨噬細(xì)胞中TLR4的表達,同時顯著抑制TLR2的表達。本文旨在探討小鼠巨噬細(xì)胞中CD38對TLR2表達以及巨噬細(xì)胞功能的影響及其可能的分子機制,從而為進一步闡明CD38在炎癥反應(yīng)中的作用及其機制提供實驗依據(jù)。
　　方法:1.原代細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定:小鼠腹腔注射3ml4％硫膠質(zhì)促使巨噬細(xì)胞聚集,5天后收獲細(xì)胞并于孵箱體外培養(yǎng)2天,確認(rèn)基因型;2.檢測巨噬細(xì)胞TLR2的表達

3、;3. TLR2啟動子區(qū)核心序列的構(gòu)建及確定:設(shè)計TLR2上游區(qū)5kb至1kb的啟動子區(qū)引物,將不同長度的片段分別構(gòu)建入pGL3載體中,轉(zhuǎn)染進細(xì)胞,進行雙熒光素酶活性測定;4.生物信息學(xué)分析:用公認(rèn)的信息數(shù)據(jù)庫MotifMap及UCGU進行TLR2上游轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測和分析;5.核心區(qū)驗證:使用等長度片段擴增,進行核心區(qū)突變與刪除,進行雙熒光素酶活性測定。6.熒光定量RT-PCR技術(shù)分析CD38敲除后TLR2對炎癥因子的影響。
　　

4、結(jié)果:1.原代分離并培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,鏡下觀察其形態(tài)、大小及聚散性與報道相符,確認(rèn)為巨噬細(xì)胞。2. CD38基因敲除的小鼠巨噬細(xì)胞中TLR2表達下降。3.信息數(shù)據(jù)庫 MotifMap顯示 TLR2啟動子的核心序列為GGGANNNTCC。4.生物信息學(xué)預(yù)測 CD38調(diào)控 TLR2的可能的轉(zhuǎn)錄因子為NF-κB。5.實驗驗證TLR2的上游轉(zhuǎn)錄因子確為NF-κB。6. TLR2基因抑制后,下游炎癥因子Arg1和IL-10表達顯著升高; TN