CD38基因表達(dá)促進(jìn)血管緊張素II誘導(dǎo)的心肌肥大的作用及其機(jī)制.pdf

1、目的：
　　心肌肥大是由多種心血管疾病如高血壓、心瓣膜病及心肌炎等引起的一種心臟功能的代償性改變，其主要特征為心肌細(xì)胞體積增大、細(xì)胞外基質(zhì)增多而誘導(dǎo)的心肌纖維化。臨床上長期持續(xù)性的心肌肥厚是引起心臟衰竭甚至猝死的一個(gè)重要原因，然而目前尚無十分有效的防治方法?，F(xiàn)有文獻(xiàn)資料表明，多條信號(hào)通路參與心肌肥大的調(diào)節(jié)，然而調(diào)節(jié)這些通路的分子機(jī)制尚未完全闡明。因此，尋找新的介導(dǎo)心肌肥厚的特異性分子及其相關(guān)信號(hào)通路，對于進(jìn)一步闡明心肌肥大的發(fā)生機(jī)

2、制，發(fā)現(xiàn)心肌肥大防治的新靶點(diǎn)具有非常重要的理論和臨床意義。在我們的早期研究中，我們發(fā)現(xiàn)CD38基因缺失的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞對H2O2和缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷具有顯著的保護(hù)作用，并證明這種保護(hù)作用可能與CD38基因缺失導(dǎo)致SIRT1-FOXO1信號(hào)通路激活，進(jìn)而減輕缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌損傷有關(guān)。然而，CD38對心肌肥大中的影響尚無報(bào)道。本文旨在探索CD38基因在血管緊張素II（angiotensin II，AngII）誘導(dǎo)小鼠心肌肥大發(fā)

3、生發(fā)展過程中的作用及其機(jī)制，從而為心肌肥大的預(yù)防與治療提供新的作用靶點(diǎn)與研究思路。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1. AngII誘導(dǎo)小鼠心肌肥大模型的制備及其分析：選用10-12周齡的CD38基因缺失小鼠與C57BL/6野生型小鼠進(jìn)行基因型鑒定，并采用ALZET2002微滲透泵，以1500ng/kg/day的量，皮下注射AngII14天制備小鼠心肌肥大模型；Softron BP-98A系統(tǒng)帶尾套管法檢測小鼠血壓；測量小鼠心臟重量和體

4、重，分析小鼠心臟體重比差異；取模型鼠心臟固定，石蠟包埋，3μm切片后，F(xiàn)ITC標(biāo)記的 Wheat germ agglutinin染色法檢測心肌細(xì)胞的肥大程度；采用天狼星紅、Masson染色法檢測組織細(xì)胞的纖維化；Vevo770高分辨率心臟超聲儀檢測小鼠心臟的肥厚程度與心臟收縮功能；檢測小鼠心肌肥大的相關(guān)生化指標(biāo)。
　　2.離體心肌細(xì)胞肥大模型的制備及其分析：1）利用RNAi技術(shù)構(gòu)建CD38敲減H9c2穩(wěn)定細(xì)胞系，采用Western

5、 blot檢測穩(wěn)定細(xì)胞系中CD38的干擾效率；2）體外心肌細(xì)胞肥大模型的構(gòu)建：采用不同濃度的 AngII處理 H9c2細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測心肌肥大標(biāo)記分子BNP的mRNA轉(zhuǎn)錄水平差異以確認(rèn)心肌細(xì)胞肥大模型的建立；3）心肌肥大生物標(biāo)記物的檢測：2μmol AngII處理CD38干擾H9c2細(xì)胞及其對照組細(xì)胞48小時(shí)后，瞬時(shí)定量PCR法檢測肥大標(biāo)記分子ANP和BNP的mRNA轉(zhuǎn)錄水平差異；4）細(xì)胞大小的染色法測定：2μmol Ang

6、II處理CD38干擾H9c2細(xì)胞及其對照組細(xì)胞48小時(shí)后，90％乙醇固定20分鐘，結(jié)晶紫染色；5）細(xì)胞氧自由基檢測：2μmol AngII處理H9c2細(xì)胞20分鐘后，活性氧染料H2DCF-DA孵育15分鐘，流式細(xì)胞儀檢測其熒光強(qiáng)度。
　　3.心肌肥大信號(hào)通路的機(jī)制分析：1）Western blot分析AngII處理細(xì)胞后，對照組及CD38基因干擾組H9c2中SIRT3表達(dá)量；2）Q-PCR分析CD38基因干擾對FOXO3及其下游基

7、因Bcl2、ARC和SOD2轉(zhuǎn)錄的影響；3）Western blot檢測AngII處理細(xì)胞后，對照組及CD38基因干擾組H9c2中AKT、ERK及GSK3β蛋白磷酸化。4）2μmol AngII處理CD38干擾H9c2細(xì)胞及其對照組細(xì)胞20分鐘以Flu-3am染色，熒光倒置顯微鏡檢測細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化；5）分離CD38干擾H9c2細(xì)胞及其對照組細(xì)胞胞核胞漿蛋白，采用Western blot法檢測NFATc4核漿蛋白表達(dá)。
　　

8、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.整體動(dòng)物水平證明CD38基因缺失對血管緊張素II誘導(dǎo)的小鼠心肌肥大具有顯著的保護(hù)作用：1）微滲透皮下注射AngII14天可使小鼠血壓出現(xiàn)明顯升高，且野生型小鼠組與 CD38基因缺失小鼠組并無顯著差異。2）AngII誘導(dǎo)心肌肥大模型14天后，心臟超聲檢測顯示AngII可致小鼠心臟收縮期及舒張期的心室后壁厚度明顯增加，而 CD38基因缺失小鼠較野生型小鼠其心肌肥厚程度有所減輕。同時(shí)，野生型小鼠的左心室重量與體重比顯

9、著增加，而 CD38基因缺失小鼠的增加并不明顯；3）Wheat germ agglutinin染色顯示，模型小鼠的心肌細(xì)胞大小均有一定程度增加，且野生型小鼠較CD38基因型缺失小鼠其增加更為顯著。4）天狼星紅和 Masson染色顯示小鼠在 AngII處理后均出現(xiàn)一定程度的心肌纖維化，而野生型小鼠的心肌纖維化程度較CD38基因缺失小鼠明顯加重。
　　2.離體水平研究表明CD38基因干擾明顯耐受AngII誘導(dǎo)的H9c2心肌肥大：1）采

10、用RNAi方法成功制備了CD38基因敲減的H9c2穩(wěn)定細(xì)胞系，經(jīng)Western blot驗(yàn)證，其CD38基因蛋白表達(dá)量可降低60%以上；2）不同濃度AngII均可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大標(biāo)記分子BNP的轉(zhuǎn)錄顯著增加，并呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性；3）2μmol AngII處理細(xì)胞48小時(shí)后，對照組心肌細(xì)胞ANP和BNP的表達(dá)顯著上升，而CD38干擾組心肌細(xì)胞表達(dá)量明顯減輕；4）結(jié)晶紫染色顯示AngII可顯著增加對照組H9c2細(xì)胞的大小，而CD38干

11、擾可明顯減輕AngII誘導(dǎo)的肥大；5） CD38基因干擾可顯著減輕AngII誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞內(nèi)氧自由基升高。
　　3.干擾 CD38基因可能通過激活 SIRT3-FOXO3信號(hào)通路，進(jìn)而抑制 AngII誘導(dǎo)的心肌肥大：結(jié)果顯示，1）干擾CD38基因可明顯促進(jìn)心肌細(xì)胞SIRT3蛋白表達(dá)；2）干擾CD38基因可明顯促進(jìn)FOXO3及其下游Bcl2、ARC和SOD2基因的轉(zhuǎn)錄；3）干擾CD38基因可顯著抑制AngII誘導(dǎo)的AKT、ERK

12、及GSK3β蛋白磷酸化。
　　4.干擾 CD38基因可抑制 AngII誘導(dǎo)的 H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)鈣釋放和calcineunin-NFATc4信號(hào)通路的激活：干擾CD38基因可顯著減輕AngII誘導(dǎo)的胞內(nèi)鈣釋放；2）NFATc4在H9c2細(xì)胞中主要表達(dá)于細(xì)胞核，并且在CD38干擾細(xì)胞組中其核表達(dá)少于對照組。
　　結(jié)論：
　　1. CD38基因缺失可明顯減輕 AngII誘導(dǎo)的整體小鼠心肌肥大及心肌纖維化。
　　2.干