血管緊張素Ⅱ誘導其前體基因表達及促進血管平滑肌細胞增殖的作用機制研究.pdf

1、血管平滑肌細胞(vascular smooth nluscle cells，VSMC)異常增殖是動脈粥樣硬化斑塊形成、高血壓和血管成形術后再狹窄等血管增殖性疾病共同的細胞病理學基礎。雖然多種細胞因子和血管活性物質(zhì)能促進VSMC的增殖，但血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)在VSMC增殖及高血壓、動脈粥樣硬化、血管再狹窄等血管重塑性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中處于關鍵地位。已經(jīng)證明，在心血管系統(tǒng)中，VSMC不僅是AngⅡ的一個重要來

2、源，而且也是AngⅡ調(diào)節(jié)血管功能的重要靶細胞。因此，研究AngⅡ調(diào)節(jié)其前體基因表達及促進VSMC增殖的作用機制，對闡明血管增殖性疾病的分子機制具有重要意義。 細胞核內(nèi)的c-Jun水平即顯著升高并在此水平上保持至3 h。而且，免疫細胞化學染色證實，AngⅡ誘導表達的c-Jun主要分布在細胞核內(nèi)。用抗絲氨酸磷酸化抗體對核提取物進行免疫沉淀后檢測磷酸化型c-Jun水平時發(fā)現(xiàn)，伴隨著c-Jun表達增高，磷酸化型c-Jun水平也平行升高。

3、用CHX預處理VSMC 0.5 h后，再用AngⅡ刺激，c-Jun表達雖然不受影響，但其磷酸化水為了闡明AngⅡ調(diào)節(jié)血管緊張素原基因表達及促進VSMC增殖的分子機制，本研究觀察AngⅡ?qū)D(zhuǎn)錄激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)表達活化及其對血管緊張素原基因表達的影響；探討AP-1與信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子5(signal transducer and activator of transcription 5，S

4、TAT5)在調(diào)節(jié)血管緊張素原基因表達中的相互關系；確定AngⅡ誘導VSMC增殖的信號轉(zhuǎn)導途徑及roscovitine抗VSMC增殖的作用靶點。 1 AngⅡ調(diào)節(jié)其前體基因在VSMC中表達的分子機制 AP-1是一種激活細胞增殖相關基因表達的轉(zhuǎn)錄因子，在AngⅡ誘導其前體基因表達過程中，伴有AP-1(Fos-Jun二聚體)與血管緊張素原基因啟動子結(jié)合活性的增強。 為進一步探討AngⅡ促進AP-1與其順式元件結(jié)合的分子

5、機制。本部分實驗用放線菌酮(cycloheximide，CHX)作為c-Jun的阻斷劑，觀察AngⅡ?qū)P-1與血管緊張素原基因啟動子相互作用及對血管緊張素原基因表達的影響。實驗結(jié)果如下： 1.1 不同劑量CHX對VSMC活力的影響 為了觀察CHX對VSMC是否具有的毒性，用不同劑量的CHX處理VSMC后，進行MTT分析。結(jié)果顯示，在15～45μmol/L濃度范圍內(nèi)，vSMC活力無明顯變化。提示在該濃度范圍內(nèi)，CHX對V

6、SMC不產(chǎn)生毒性作用。 1.2 AngⅡ促進c-Jun蛋白表達與磷酸化 Western bloe結(jié)果顯示，AngⅡ作用于VSMC 0.5 h后，平明顯降低。結(jié)果提示，AngⅡ?qū)ζ淝绑w基因的正反饋調(diào)節(jié)是通過促進AP-1表達及誘導c-Jun磷酸化活化而實現(xiàn)的，CHX是一種AP-1磷酸化的抑制劑。 1.3 CHX抑制AngⅡ誘導的血管緊張素原基因表達 用RT-PCR檢測CHX抑制c-Jun磷酸化對血管緊張素原基

7、因表達的影響。結(jié)果顯示，用AngⅡ處理VSMC3h，可顯著提高血管緊張素原基因的表達活性。用CHX預處理VSMC可抑制AngⅡ誘導的血管緊張素原基因表達。由此可見，CHX對c-Jun磷酸化的抑制可下調(diào)血管緊張素原基因的表達活性，提示AP-1的磷酸化活化是該基因表達所必需的。 1.4 AngⅡ促進AP-1與血管緊張素原基因啟動子結(jié)合 為尋找AngⅡ誘導c-Jun磷酸化與其促進血管緊張素原基因表達之間的關系，用EMSA檢測A

8、ngⅡ?qū)P-1與其順式元件結(jié)合活性的影響。結(jié)果顯示，AngⅡ處理VSMC 0.5 h后，核蛋白與探針的結(jié)合活性顯著升高，至3 h達高峰。分別加入抗c-Jun和抗STAT5b抗體進行超遷移分析，均可出現(xiàn)抗體.抗原一探針形成的超遷移條帶。在CHX預處理的細胞，其核蛋白與探針的結(jié)合活性明顯下降。為了查明CHX抑制AP-1結(jié)合活性的機制，對同樣條件下收集的核蛋白進行Westem blot分析。結(jié)果表明，CHX對AP-1結(jié)合活性的抑制效應與AP

9、-1蛋白水平無關，而是CHX抑制AP-1磷酸化的直接結(jié)果。上述結(jié)果提示，AngⅡ誘導AP-1磷酸化是AngⅡ?qū)ρ芫o張素原基因正反饋調(diào)節(jié)的機制之一。 2 Roscovitine抑制血管平滑肌細胞增殖與c-Jun表達之間的關系 ROSCOvitine作為一種細胞周期蛋白依賴激酶(CDKs)的特異性抑制劑，具有誘導腫瘤細胞凋亡和抑制細胞增殖的作用。但roscovitine對VSMC增殖是否具有抑制作用，以及其對VSMC的抑制

10、效應及作用機制與其他細胞是否相同目前尚不清楚。 本部分比較roscovitine對VSMC和不同組織來源的細胞系增殖的影響及其作用機制。 2.1 Roscovitine對細胞增殖的影響 用細胞計數(shù)法檢測細胞增殖活力。結(jié)果顯示，被血清和AngⅡ刺激后，VSMC細胞增殖速率顯著加快，分別是對照組(無血清培養(yǎng)組)的2.63和1.68倍。不同濃度的roscovitine(15、30、45μmol/L)預處理VSMC15

11、h，均可顯著抑制AngⅡ誘導的VSMC增殖。抑制率分別為37.3％、46.7％和51.8％。Roscovitine也可顯著抑制血清誘導的VSMC增殖。結(jié)果表明，roscovitine可顯著抑制體外培養(yǎng)的VSMC增殖。 Roscovitine也顯著抑制血清誘導的HeLa、COS-7、M17細胞的增殖。Roscovitine在30μmol/L時，對HeLa、COS-7、M17細胞的增殖抑制率分別為61.8％、60.4％和54.3％

12、(p<0.001)，明顯高于對VSMC的抑制作用。結(jié)果提示，不同細胞對roscovitine的敏感性有所不同。 2.2 Roscovitine對c-Jun蛋白表達的影響 免疫細胞化學染色結(jié)果顯示，在AngⅡ刺激的VSMC中，c-Jun表達明顯增多。Roscovitine預處理VSMC可使c-Jun的表達明顯下降。Westernblot結(jié)果進一步證實，AngⅡ和血清刺激VSM C可顯著誘導c-Jun蛋白的表達，roscov

13、itine預處理細胞15 h可顯著抑制AngⅡ誘導的c-Jun表達。然而，在HeLa、COS-7和M17細胞中，roscovitine預處理細胞對c-Jun蛋白表達無明顯影響。在HeLa、COS-7、M17和VSMC中，roscovitine均不影響STAT5b的表達水平。結(jié)果提示，roscovitine抗VSMC增殖的作用與其抑制c-Jun表達有關；roscovitine抑制HeLa、COS-7和M17增殖與抑制c-Jun表達無關。說

14、明roscovitine抗細胞增殖的機理在不同細胞是不同的。 2.3 Roscovitine在轉(zhuǎn)錄水平上抑制c-jun基因在VSMC中的表達 為進一步探討roscovitine抑制c-Jun表達的作用環(huán)節(jié)，用roscovitine處理VSMC、HeLa與M17細胞后，用RT-PCR檢測c-jun基因的轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)果顯示，roscovitine可下調(diào)VSMC中c-jun mRNA水平，但不影響HeLa和M17細胞對c-ju

15、n mRNA的表達，與Western blot結(jié)果一致。結(jié)果提示，roscovitine通過抑制c-jun基因轉(zhuǎn)錄而導致VSMC中c-Jun蛋白水平下降。 3 AngⅡ促進VSMC增殖的信號轉(zhuǎn)導途徑及Roscovitine抑制VSMC增殖的作用靶點 AngⅡ通過與VSMC上的相應受體相互作用而觸發(fā)細胞增殖信號轉(zhuǎn)導過程，最終引起細胞增殖相關基因表達及VSMC大量增殖。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated

16、protein kinase，MAPK)級聯(lián)反應是轉(zhuǎn)導細胞增殖信號進入細胞核的一條重要信號轉(zhuǎn)導通路。本部分研究觀察roscovitine對MAPK信號通路以及對血管緊張素原基因表達的影響，進一步闡明roscovitine抑制VSMC增殖與細胞增殖信號轉(zhuǎn)導之間的關系。 4 AP-1與STAT5在調(diào)節(jié)血管緊張素原基因表達中的相互作用 AngⅡ誘導其前體基因表達與AP-1和STAT5磷酸化活化有關，表明AP-1與STAT5均參

17、與血管緊張素原基因的反式激活過程。本部分實驗探討這兩種轉(zhuǎn)錄因子在血管緊張素原基因轉(zhuǎn)錄激活過程中的相互作用。 結(jié)論 1．AngⅡ通過促進AP-1表達及磷酸化活化正反饋調(diào)節(jié)其前體基因表達。 2．ROSCOvitine通過特異性抑制c-Jun表達而發(fā)揮其對VSMC的抗增殖作用。 3．Roscovitine抑制VSMC增殖與抑制ERK1/2信號轉(zhuǎn)導通路有關。 4．STAT5和c-Jun對血管緊張素原基因的