磷酸酶與張力蛋白同源物PTEN過度表達(dá)負(fù)性調(diào)控血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大及其機(jī)制.pdf

1、該研究發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞內(nèi)同時存在著心肌細(xì)胞肥大的負(fù)性調(diào)控因素，這些信號分子通過與促心肌細(xì)胞肥大因子的相互作用，維持著細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能與基因表達(dá)狀態(tài)的平衡。磷酸酶與張力蛋白同源物PTEN可能參與了對心肌肥大的負(fù)性調(diào)節(jié)。異丙腎上腺素能夠增加心肌內(nèi)PTEN表達(dá)；心肌細(xì)胞內(nèi)PTEN的過度表達(dá)能明顯抑制IGF-1誘導(dǎo)的心肌肥大，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡；PTEN可通過與不同亞型的PI3K相互作用，PTEN/PI3Kα信號通路能抑制心肌肥厚，PTEN/PI3Kγ

2、調(diào)節(jié)心臟功能。以上研究結(jié)果提示在心肌肥大過程中，刺激因素引起心肌肥大信號通路激活的同時，也激活了PTEN參與的負(fù)性調(diào)控通路。 本實驗探討PTEN過度表達(dá)對血管緊張素Ⅱ刺激所致的適應(yīng)不良性心肌細(xì)胞肥大的影響，以期進(jìn)一步了解PTEN在心肌肥大中的作用及其機(jī)制。 研究方法： 1.通過定向克隆和基因重組構(gòu)建攜帶野生型PTEN基因的腺病毒載體(Ad-PTEN)，同時構(gòu)建攜帶G129E(喪失了脂質(zhì)磷酸酶活性，僅保留蛋白磷酸酶

3、活性的PTEN突變體)基因的腺病毒載體(Ad-G129E)。 2.通過病毒感染構(gòu)建過度表達(dá)PTEN或G129E的原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞模型，通過追蹤綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)，檢測不同感染倍數(shù)(M.O.I.)的感染效率，以及感染后24h，48h和72h時GFP表達(dá)陽性率；結(jié)合MTT法觀察受感染心肌細(xì)胞活力，確定合適的感染倍數(shù)和病毒表達(dá)時間。 3.用RT-PCR和WesternBlot檢測受感染細(xì)胞內(nèi)PTEN或G129E的mR

4、NA和蛋白表達(dá)，檢測通過腺病毒感染介導(dǎo)能否有效地引起心肌細(xì)胞內(nèi)過度表達(dá)PTEN或G129E。 4.用AngⅡ作為促心肌肥大刺激劑，觀察PTEN或G129E過度表達(dá)對心肌細(xì)胞肥大的影響，ANF、β-NHC和細(xì)胞直徑作為肥大指標(biāo)，僅攜帶GFP的空病毒(Ad-GFP)作為對照。 5.Furo-2/AM比率熒光成像系統(tǒng)檢測細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度([Ca2+]i)、RT-PCR檢測細(xì)胞內(nèi)CaNAβ的mRNA，WesternBlot檢測

5、CaNAβ、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(Extracellularsignal-regulatedkinase1/2；ERK1/2)和磷酸化ERK1/2(pERK1/2)的蛋白表達(dá)，同時測定CaN磷酸酶活性。 結(jié)果： 1.通過同源重組，在AD293包裝細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生了具有感染能力的腺病毒顆粒；通過反復(fù)感染過程，獲得較高滴度腺病毒液。 2.Ad-PTEN，Ad-G129E和Ad-GFP感染心肌細(xì)胞后，GFP表達(dá)陽性率隨著

6、M.O.I.和時間增加而增加；M.O.I.達(dá)到100以上時，細(xì)胞GFP陽性率達(dá)到90％以上；各種M.O.I.感染48h后，GFP陽性表達(dá)趨于穩(wěn)定，因此確定感染后48h作為進(jìn)行后續(xù)實驗的適宜表達(dá)時間。 3.MTT結(jié)果顯示，病毒感染后48h，隨著M.O.I.的增加，細(xì)胞活力呈現(xiàn)下降趨勢(Ad-GFP：β=-0.217，p＞0.05；Ad-PTEN：β=-0.470，p＜0.05；Ad-G129E：β=-0.372，p＜0.05)。M

7、.O.I.超過100后細(xì)胞活力明顯下降；因此采用M.O.I.100，感染后48h作為下一步實驗的條件。 4.RT-PCR和WesternBlot檢測顯示，攜帶外源基因PTEN或G129E的腺病毒感染后，心肌細(xì)胞內(nèi)過度表達(dá)PTEN或G129E的mRNA和蛋白。 5.AngⅡ刺激能夠引起心肌細(xì)胞肥大，伴有肥大標(biāo)志基因ANF、β-MHC表達(dá)顯著增高；而PTEN的過度表達(dá)能夠明顯抑制AngⅡ刺激所致的心肌細(xì)胞肥大和胚胎型基因表達(dá)

8、；G129E過度表達(dá)與PTEN過度表達(dá)相比，肥大抑制作用明顯降低。 6.AngⅡ刺激使[Ca2+]i明顯增高，PTEN過度表達(dá)能夠明顯抑制AngⅡ引起的[Ca2+]i增高，G129E過度表達(dá)心肌細(xì)胞[Ca2+]i顯著高于PTEN過度表達(dá)的心肌細(xì)胞。 7.AngⅡ刺激使CaNAβmRNA與蛋白表達(dá)明顯增高，PTEN過度表達(dá)能夠明顯抑制AngⅡ引起的CaNAβmRNA與蛋白表達(dá)，G129E過度表達(dá)的心肌細(xì)胞內(nèi)CaNAβmRN

9、A與蛋白表達(dá)顯著高于PTEN過度表達(dá)的心肌細(xì)胞。 8.AngⅡ刺激使CaN磷酸酶活性明顯增高，PTEN過度表達(dá)能夠明顯抑制AngⅡ引起的CaN磷酸酶活性增高，G129E過度表達(dá)的心肌細(xì)胞內(nèi)CaN磷酸酶活性顯著高于PTEN過度表達(dá)的心肌細(xì)胞。 9.AngⅡ刺激使ERK1/2與pERK1/2蛋白表達(dá)明顯增高，PTEN過度表達(dá)能夠明顯抑制AngⅡ引起的ERK1/2與pERK1/2蛋白表達(dá)，G129E過度表達(dá)的心肌細(xì)胞內(nèi)ERK1

10、/2與pERK1/2蛋白水平顯著高于PTEN過度表達(dá)的心肌細(xì)胞。 結(jié)論： 通過腺病毒介導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)PTEN過度表達(dá)能夠明顯抑制AngⅡ刺激引起的心肌細(xì)胞肥大反應(yīng)，而G129E過度表達(dá)則對心肌細(xì)胞肥大的抑制能力明顯降低，提示PTEN的脂質(zhì)磷酸酶活性參與了對AngⅡ誘導(dǎo)心肌肥大的負(fù)性調(diào)控過程；同時，PTEN對AngⅡ激活的Ca2+/CaN/NFAT3和MEK1/ERK1/2信號通路表現(xiàn)出明顯的抑制作用，這些信號通路可能參與