磷酸酶與張力蛋白同源物PTEN抑制TGFβ1刺激的大鼠腎成纖維細胞增殖及ColⅣ、FN分泌.pdf

1、背景與目的： 腎組織纖維化是所有慢性腎臟疾病導致終末期腎功能衰竭的主要病理機制。迄今仍無有效阻止腎組織纖維化發(fā)生發(fā)展的確切方法。現(xiàn)有的研究表明，細胞外基質(zhì)(Extracellularmatrix，ECM)在腎組織的過度沉積是引起腎組織纖維化的主要原因，而腎成纖維細胞是腎組織中產(chǎn)生ECM的主要細胞。因此，能否阻止腎組織纖維化進程關(guān)鍵在于能否阻斷腎成纖維細胞的過度增殖和分泌。 染色體10上缺失的磷酸酶與張力蛋白同源物基因(P

2、hosphataseandtensinhomologdeletedonchromosome10，PTEN)是新近發(fā)現(xiàn)的一個腫瘤抑制基因。PTEN蛋白具有脂性磷酸酯酶活性和蛋白性磷酸酯酶活性，可以抑制磷酯酰肌醇三磷酸激酶(Phosphatidylinosito1-3-kinase，PI3K)信號傳導通路并參與負性調(diào)控絲裂原激活的蛋白激酶(Mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)信號傳導通路。已有的研究表明P

3、I3K和MAPK信號傳導通路參與了細胞遷移、炎癥反應、細胞增殖和細胞周期調(diào)控等一系列過程，在腎組織纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。因此PTEN有可能在腎組織纖維化過程中起重要的調(diào)節(jié)作用。 本實驗擬通過觀察轉(zhuǎn)化生長因子β1(Transforminggrowthfactor-beta，TGFβ1)刺激體外培養(yǎng)的大鼠腎成纖維細胞后，細胞表達PTEN的變化，以及PTEN蛋白對TGFβ1誘導的腎成纖維細胞增殖和分泌Ⅳ型膠原(Collage

4、nⅣ，ColⅣ)、纖連蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)的影響，探討PTEN蛋白在腎組織纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用，為腎組織纖維化的防治提供新的思路。 方法： 1.分離、純化、培養(yǎng)大鼠腎成纖維細胞，并用光電鏡、免疫細胞化學進行細胞鑒定。 2.轉(zhuǎn)染攜帶PTEN基因的腺病毒及僅帶綠色熒光蛋白(Greenfluorescenceprotein，GFP)基因的空病毒載體，通過檢測GFP陽性細胞比率了解轉(zhuǎn)染效率，并結(jié)合四甲基

5、偶氮唑法(Metromethylthiazolylblue，MTT)測定細胞活力確定最佳轉(zhuǎn)染倍數(shù)及最佳轉(zhuǎn)染后表達時間。利用RT-PCR及免疫細胞化學檢測轉(zhuǎn)入的PTEN基因是否有效表達。 3.TGFβ1刺激培養(yǎng)的大鼠腎成纖維細胞，通過RT-PCR及免疫細胞化學檢測TGFβ1刺激后PTENmRNA和蛋白表達的變化；通過MTT法檢測細胞活力，免疫細胞化學檢測增殖細胞核抗原(Proliferatingcellnuclearantigen

6、，PCNA)表達，以了解PTEN基因編碼蛋白對TGFβ1刺激所致成纖維細胞增殖的影響；通過酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)檢測ColⅣ、FN含量，以了解PTEN基因編碼蛋白對TGFβ1刺激所致細胞分泌ColⅣ、FN的影響。 結(jié)果： 1.通過改進細胞消化方法，成功分離培養(yǎng)了大鼠腎成纖維細胞，為后續(xù)研究提供了重要的實驗保證。 2.攜帶PTEN基因的腺病毒及僅

7、帶GFP基因的空病毒載體轉(zhuǎn)染腎成纖維細胞后24、36、48h，隨著感染倍數(shù)(Multiplicityofinfection，MOI)增高，轉(zhuǎn)染效率增加。轉(zhuǎn)染后36h所有MOI的細胞熒光明顯增多、增強，其中PTEN組、GFP組MOI=200的GFP陽性細胞比率分別達86.7％、84.7％，且細胞活力無顯著下降，轉(zhuǎn)染后48h所有MOI的GFP陽性細胞比率與轉(zhuǎn)染后36h相比無明顯差異。因此，后續(xù)實驗采用MOI=200轉(zhuǎn)染36h。 3.

8、正常大鼠腎成纖維細胞可以表達PTENmRNA和蛋白，免疫細胞化學結(jié)果顯示PTEN蛋白在胞漿、胞核均有表達。RT-PCR及免疫細胞化學結(jié)果顯示攜帶PTEN基因的腺病毒轉(zhuǎn)染腎成纖維細胞后，細胞能有效表達PTENmRNA和蛋白，其表達量較空白對照組及GFP空病毒組明顯增加(P＜0.05)。 4.給予TGFβ1刺激后，腎成纖維細胞表達PTENmRNA和蛋白量較空白對照組明顯減少(P＜0.05)。 5.給予TGFβ1刺激后，腎成纖

9、維細胞增殖能力明顯增強，PTEN蛋白大量表達能抑制TGFβ1刺激所致細胞增殖，表現(xiàn)為MTT檢測細胞活力顯著下降(P＜0.01)和PCNA蛋白表達明顯減少(P＜0.05)。 6.ELISA結(jié)果顯示，給予TGFβ1刺激后，腎成纖維細胞分泌ColⅣ、FN明顯增多，PTEN蛋白大量表達能明顯抑制TGFβ1刺激所致ColⅣ、FN的分泌(P＜0.05)。 結(jié)論： 正常大鼠腎成纖維細胞可以表達PTENmRNA和蛋白，TGFβ1