TLR2及TLR4活化對人骨髓間充質(zhì)干細胞造血支持功能的影響.pdf

1、背景和目的:Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類天然免疫受體,在激活天然免疫和獲得性免疫中發(fā)揮重要的作用。間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stromal cells,MSC)是一種具有高度自我更新能力和多向分化潛能的成體干細胞。最近研究表明Toll樣受體(toll-like receptors)可表達于MSC表面,并且可以調(diào)節(jié)其免疫調(diào)節(jié)、遷移、損傷組織修復(fù)等多種生物學(xué)功能。作為造血微

2、環(huán)境的主要組成細胞,MSC參與造血生成,但迄今為止,TLR受體對MSC造血支持功能的調(diào)控尚不清楚。本文將研究TLR2及TLR4對MSC造血支持功能的影響,并對其作用機制進行初步研究。
　　方法:應(yīng)用Ficoll法體外分離培養(yǎng)健康供者的骨髓來源的間充質(zhì)干細胞(BM-MSC),流式細胞儀檢測骨髓間充質(zhì)干細胞表面CD14、CD34、CD31、CD45、HLA-DR、CD90、CD105、CD166、CD29、CD44、CD13及CD73

3、的表達,并利用體外誘導(dǎo)分化實驗檢測BM-MSC的成脂及成骨分化能力,鑒定MSC。RT-PCR分析BM-MSC內(nèi)TLR1-10的表達,同時應(yīng)用流式細胞術(shù)分析其表面TLR2及TLR4的表達水平。利用TLR2激動劑(PAM3CSK4)或(和)TLR4激動劑(LPS)刺激BM-MSC,MACS磁珠分選系統(tǒng)分離出新鮮臍血的CD34+造血干祖細胞,將分選的CD34+與BM-MSC共培養(yǎng),收集不同培養(yǎng)時間點的細胞,進行克隆形成實驗和有核細胞計數(shù),并利

4、用流式細胞術(shù)分析擴增后細胞的多種分化指標(biāo)(CD3、CD19、Gly-a、CD41a、CD13、CD11b、CD11c、CD14)的表達情況;了解TLR2或(和)TLR4的活化對BM-MSC支持CD34+造血干祖細胞增殖和分化的影響。同時應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測PAM3CSK4或(和) LPS活化BM-MSC不同時間后,多種相關(guān)造血生長因子(IL-1、IL-3、IL-8、IL-11、G-CSF、GM-CSF、SCF、M-CSF

5、及EPO)分泌水平的變化。
　　結(jié)果:流式結(jié)果顯示BM-MSC表達CD90、CD105、CD166、CD29、CD44、CD13及CD73,不表達CD14、CD34、CD31、CD45及HLA-DR,BM-MSC能夠體外誘導(dǎo)分化成成骨細胞及脂肪細胞;RT-PCR分析表明在 mRNA水平,BM-MSC表達TLR1-6,不表達TLR7-10,流式細胞術(shù)進一步證實其表面有TLR2及TLR4的表達;在給予PAM3CSK4或LPS短暫刺激B

6、M-MSC24小時后,能夠顯著增強CD34+細胞的體外擴增能力;擴增后細胞進行克隆形成實驗表明,對照組的總集落(CFU-total),粒系集落形成單位(CFU-G)、爆發(fā)式紅系形成單位(BFU-E)、巨噬系集落形成單位(CFU-M)、混合系集落形成單位(CFU-GEMM)分別為:(66.0±5.9)、(43.5±5.5)、(3.0±2.4)、(15.0±4.4)及(4.5±1.1)。對照組PAM3CSK4及LPS組的總集落(CFU-to

7、tal),粒系集落形成單位(CFU-G),爆發(fā)式紅系形成單位(BFU-E)較對照組明顯增加;隨后的表型分析顯示,與對照組相比,PAM3CSK4及 LPS組的 CD13表達水平對照組明顯增加,同時PAM3CSK4的Gly-a較對照組明顯增加,進一步對其它髓系標(biāo)志(CD11b、CD11c、CD14)研究顯示,PAM3CSK4及LPS組較對照組均明顯增加。BM-MSC在給予PAM3CSK4或(和)LPS活化后,BM-MSC不同時間后除IL-3