TLR2-TLR4活化相關微小RNA對人骨髓間充質干細胞造血支持功能的調控作用.pdf

1、背景和目的：
　　間充質干細胞（MSCs）是一種多能干細胞，具有高度自我更新和分化潛能，多種組織、器官均可分離提取出MSCs。其中，骨髓間充質干細胞（BM-MSCs）是MSCs最豐富的來源，且易于獲取。Toll樣受體（TLRs）是參與天然免疫和獲得性免疫的一類重要蛋白分子。MicroRNA（miRNA）是一類具有調控功能的非編碼小分子RNA，大小約19-23個核苷酸，主要在轉錄后對靶基因進行調控。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)和證實m

2、iRNA參與MSCs的增殖、分化、遷移、生存以及旁分泌等一系列生理和病理過程，并在調控MSCs的造血支持療效上起了重要作用。目前，多種細胞類型中已證實：TLR信號可調節(jié)miRNA的表達，反之miRNA又可作為重要的調節(jié)分子調控TLR信號。因此有理由考慮TLR活化相關的miRNA參與調控了MSCs的多種功能。本課題組前期工作證實TLR2及TLR4表達于BM-MSCs，并且可以調節(jié)其遷移、分化等多種生物學功能。進一步采用高通量測序的方法測定

3、分析了Pam3CSK4（TLR2激動劑）或LPS（TLR4激動劑）刺激后BM-MSCs的miRNA表達譜變化，并根據(jù)miRNA表達譜的變化，我們選擇了TLR活化明顯相關的4種miRNA：高表達的miR-146a、miR-214，以及表達顯著下調的miR-323b、miR-425。觀察上述4種miRNAs對BM-MSCs遷移能力的影響，同時研究他們對BM-MSCs誘導造血干細胞遷移與分化的影響。
　　方法：
　　分離培養(yǎng)健康志

4、愿者的BM-MSCs，分別用miR-214、miR-146a、miR-323b和miR-425的類似物（miRNA mimic）或抑制劑（miRNA inhibitor）通過脂質體轉染第三代細胞，實時定量PCR（qRT-PCR）檢測各組細胞中相應miRNA的表達量。用趨化實驗觀察各組貼壁細胞的遷移能力及各組 MSCs培養(yǎng)上清對人臍帶血CD34+細胞的遷移能力的影響，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）定量檢測培養(yǎng)上清中趨化因子SDF-1的分泌水

5、平，流式細胞術檢測BM-MSCs表面趨化因子受體4（CXCR4）的表達情況。構建BM-MSCs與臍血CD34+細胞的共培養(yǎng)體系，2周后，通過流式細胞學技術檢測造血干細胞的分化情況，ELISA定量檢測培養(yǎng)上清中造血生長因子IL-1β、IL-8、G-CSF的分泌水平。
　　結果：
　　1.用miR-214、miR-146a、miR-323b和miR-425類似物或抑制劑分別轉染細胞后，四種 miRNA表達量均出現(xiàn)相應變化。與對照

6、組相比，轉染 miR-214、miR-146a、miR-323b和miR-425類似物后，相應的miRNA表達顯著上調；轉染miR-214、miR-146a、miR-323b和miR-425抑制劑后，相應的miRNA表達顯著下調。
　　2.miR-323b類似物轉染的BM-MSCs的遷移能力受抑，而其抑制物組遷移力明顯增高。流式細胞術檢測比較處理后細胞表面CXCR4的表達情況，miR-323b類似物組CXCR4表達量減低。

7、　　3.在CD34+細胞遷移實驗中，較之空白對照，BM-MSCs的培養(yǎng)上清明顯促進CD34+細胞遷移；與未轉染對照組、陰性對照組（NC組）相比，miR-214類似物組BM-MSCs培養(yǎng)上清明顯促進CD34+細胞的遷移，而miR-214抑制物組表現(xiàn)為抑制CD34+細胞的遷移。ELISA檢測各組的SDF-1濃度無明顯差異。
　　4.將各組細胞與CD34+細胞共培養(yǎng)兩周后，CD34+細胞的分化趨勢有差異，其中miR-425表達上調的BM

8、-MSCs可明顯誘導CD34+細胞向髓系分化。
　　5.BM-MSCs的培養(yǎng)上清中IL-1β、IL-8、G-CSF分泌水平變化情況：miR-425類似物組G-CSF的分泌量明顯高于對照組。
　　結論：
　　1.miR-323抑制了BM-MSCs遷移能力，可能與BM-MSCs表面CXCR4表達受抑有關。
　　2.高表達miR-214的BM-MSCs培養(yǎng)上清可促進CD34+細胞的遷移，其原因與SDF-1無明顯相關性。