KGF-2在擬南芥雙油體系統(tǒng)中的表達(dá)及其生物活性研究.pdf

1、目的:構(gòu)建p1301-Y0-Y0-K2，p1301-Y0-K2-Y0兩種雙油體KGF-2融合蛋白表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化擬南芥，與p1301-Y0-K2單油體表達(dá)載體對比，觀察是否能夠提高外源蛋白KGF-2的表達(dá)量，并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測融合蛋白的生物學(xué)活性。
　　方法:利用PCR擴(kuò)增擬南芥（Arabidopss thaliana）油體蛋白o(hù)leosin和植物偏好型角質(zhì)細(xì)胞生長因子-2(KGF-2)基因片段，然后分別設(shè)計(jì)兩對引物，通過融合PCR

2、技術(shù)獲得oleosin-KGF-2和KGF-2-oleosin融合基因，與包含有一個(gè)oleosin的p1301-Y0載體連接，構(gòu)建p1301-Y0-Y0-K2（oleosin-oleosin-KGF-2）和p1301-Y0-K2-Y0（oleosin-KGF-2-oleosin）表達(dá)載體，凍融法將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，利用農(nóng)桿菌浸花法在花苞期侵染野生型擬南芥，待其正常生長成熟，收獲T1代種子。由于表達(dá)載體中含有草胺磷(Bar)抗性基因，只有重組

3、質(zhì)粒轉(zhuǎn)入T1代擬南芥基因組的植株才能正常生長，非轉(zhuǎn)基因植株逐漸枯萎死亡，對T1代植株噴灑除草劑草胺磷，初步篩選出陽性苗，通過提取擬南芥葉片基因組，用引物擴(kuò)增出融合目的基因，即可進(jìn)一步確定其是否為轉(zhuǎn)基因植株。收獲T2代種子，Tris-HCL法提取種子總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE、Western-blot分析，觀察在相應(yīng)位置是否有特異性條帶出現(xiàn)，并利用灰度分析對兩種雙油體表達(dá)載體和單油體表達(dá)載體的蛋白表達(dá)量進(jìn)行比較，確定最佳表達(dá)方案。動(dòng)物實(shí)

4、驗(yàn)選取30只6-8周齡的C57BL/6小鼠隨機(jī)分為6組，分別為生理鹽水組，野生油體組，p1301-Y0-K2單油體組，p1301-Y0-Y0-K2和p1301-Y0-K2-Y0組，原核KGF-2給藥組(50ug·ml-1)，其中植物組樣品為相同量種子所提取的總蛋白，對小鼠背部進(jìn)行脫毛處理，每天進(jìn)行相同區(qū)域涂抹給藥，觀察小鼠皮膚顏色的變化周期以及長出毛發(fā)的時(shí)間。并于第十二天分別處死部分小鼠，取皮膚組織進(jìn)行HE染色，觀察毛囊形態(tài)及數(shù)量。

5、r>　　結(jié)果:載體構(gòu)建方面，將融合基因與經(jīng)過改造的植物雙元表達(dá)載體p1301-Y0連接后，PCR及測序結(jié)果都顯示p1301-Y0-Y0-K2和p1301-Y0-K2-Y0載體構(gòu)建成功。對侵染后的植株所結(jié)的T1代種子進(jìn)行除草劑篩選，然后進(jìn)行葉片基因組PCR后，確定p1301-Y0-Y0-K2組獲得16棵轉(zhuǎn)基因苗，p1301-Y0-K2-Y0組獲得15棵轉(zhuǎn)基因苗。T2代種子總蛋白的SDS-PAGE以及Western Blot結(jié)果表明p130

6、1-Y0-Y0-K2轉(zhuǎn)基因擬南芥在53.2KD左右有1條很明顯的目的條帶，p1301-Y0-K2-Y0轉(zhuǎn)基因擬南芥在53.9KD左右有1條很明顯的目的條帶，單油體轉(zhuǎn)基因擬南芥在32.7KD左右出現(xiàn)明顯條帶，與預(yù)計(jì)的融合蛋白條帶大小一致。Western-blot灰度分析結(jié)果表明，p1301-Y0-Y0-K2融合表達(dá)策略的KGF-2蛋白表達(dá)量與單油體表達(dá)載體p1301-Y0-K2相差不大，p1301-Y0-K2-Y0融合表達(dá)策略可使KGF-

7、2蛋白表達(dá)量提高至單油體表達(dá)載體的2-3倍。小鼠毛囊實(shí)驗(yàn)中，油體融合蛋白與生理鹽水組和野生油體組相比小鼠背部皮膚黑色持續(xù)時(shí)間延長(P＜0.05)，說明生長期延長，同時(shí)p1301-Y0-K2-Y0組由于相同量種子蛋白中KGF-2含量較高，促毛囊生長效果與原核KGF-2給藥組(50ug·ml-1)相當(dāng)。
　　結(jié)論:目的基因與兩個(gè)油體蛋白基因融合的表達(dá)策略優(yōu)于目的基因與單油體蛋白基因融合，尤其是p1301-Y0-K2-Y0中KGF-2的