截短型KGF-1在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)及其生物活性研究.pdf

1、目的:構(gòu)建重組桿狀病毒表達(dá)載體Bacmid-kgf1，完成桿狀病毒的傳代，擴(kuò)大病毒滴度。完成KGF-1在sf9細(xì)胞中的正確表達(dá)，初步確定表達(dá)的最佳條件。純化得到高純度蛋白，通過(guò)BaF3細(xì)胞及小鼠毛囊實(shí)驗(yàn)鑒定重組蛋白的生物學(xué)活性。
　　 方法:利用PCR擴(kuò)增截短型角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-1基因序列(kgf1)，將其克隆到pFastBac桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體上轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，這種感受態(tài)細(xì)胞中含有經(jīng)過(guò)改造的桿狀病毒載體Bacmid

2、，通過(guò)轉(zhuǎn)座子原理將kgf1重組到桿狀病毒載體上，完成Bacmid-kgf1的構(gòu)建。運(yùn)用藍(lán)白斑重復(fù)篩選的辦法挑選出高純度陽(yáng)性質(zhì)粒。使用轉(zhuǎn)染試劑盒侵染昆蟲(chóng)細(xì)胞，通過(guò)重復(fù)轉(zhuǎn)染完成病毒的傳代擴(kuò)大病毒滴度。并通過(guò)蝕斑法來(lái)計(jì)算病毒滴度大小，確定病毒的感染能力。為了提高蛋白產(chǎn)量，對(duì)蛋白表達(dá)最佳條件進(jìn)行了初步探索，首先在確定MOI條件下轉(zhuǎn)染處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的sf9細(xì)胞，每隔24h，即24，36，48，60，72，84，96，108，120h時(shí)收獲蛋白樣品

3、運(yùn)用Western Blot方法進(jìn)行鑒定確定最佳TOI;再取五瓶生長(zhǎng)狀態(tài)一致的sf9細(xì)胞，設(shè)定MOI為1，2，4，8，16，同時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞并同時(shí)收獲樣品Western Blot方法進(jìn)行鑒定確定最佳MOI。按照得出的最佳表達(dá)條件，對(duì)蛋白進(jìn)行擴(kuò)大生產(chǎn)。由于重組蛋白生物學(xué)活性的鑒定對(duì)蛋白的純度要求嚴(yán)格，所以本實(shí)驗(yàn)對(duì)收獲的蛋白樣品進(jìn)行了純化。運(yùn)用KGF-1能夠特異性結(jié)合肝素的性質(zhì)，純化第一步使用肝素親和柱進(jìn)行分離，第二步使用陽(yáng)離子交換柱進(jìn)行分離。

4、純化結(jié)果通過(guò)HPLC鑒定。KGF-1的生物學(xué)活性通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定:培養(yǎng)BaF3細(xì)胞，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基對(duì)KGF-1進(jìn)行二倍梯度稀釋分別作用于細(xì)胞，設(shè)定起始濃度為100ng/ml，終止?jié)舛葹?.1 ng/ml，48h后運(yùn)用MTT的方法檢測(cè)促增殖效果;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，選24只6-8周齡的C57BL/6小鼠隨機(jī)分為三組，昆蟲(chóng)KGF-1給藥組、原核KGF-1給藥組和生理鹽水組。給藥組每天按照1mg/kg劑量皮下給藥一次，生理鹽水組同樣方法注射生

5、理鹽水，連續(xù)三天。第四天對(duì)小鼠背部進(jìn)行剃毛處理，每天觀察毛囊生長(zhǎng)情況，并分別于第九天和第十八天處死部分小鼠，取皮膚進(jìn)行HE染色，觀察毛囊形態(tài)。
　　 結(jié)果:載體構(gòu)建部分，PCR鑒定以及基因測(cè)序結(jié)果表明Bacmid-kgf1構(gòu)建成功。轉(zhuǎn)染發(fā)生72h后發(fā)現(xiàn)，被病毒轉(zhuǎn)染的sf9細(xì)胞與正常細(xì)胞相比更大、更圓并且出現(xiàn)顆粒狀物，證明病毒轉(zhuǎn)染成功。收獲蛋白樣品的SDS-PAGE以及Western Blot結(jié)果表明，分子量約17kDa的KGF-

6、1在昆蟲(chóng)細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了表達(dá)。表達(dá)優(yōu)化條件的初步探索顯示，目的蛋白在病毒侵染細(xì)胞48 h時(shí)開(kāi)始表達(dá)，到96 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，超過(guò)96h蛋白量又有下降趨勢(shì);且MOI為4時(shí)表達(dá)量較好。蛋白純化過(guò)程中，樣品經(jīng)肝素親和柱后，目的蛋白被含有0.6M NaCl的50mM PB洗脫下來(lái)，經(jīng)過(guò)除鹽處理后進(jìn)行第二步純化，KGF-1存在于含有0.6M NaCl的50mM PB洗脫液中。HPLC結(jié)果顯示在相同洗脫條件下，目的蛋白的保留時(shí)間與陽(yáng)性對(duì)照品基本相同

7、，可見(jiàn)得到的蛋白純品確定為KGF-1，蛋白純度達(dá)到95％。Bradford蛋白濃度測(cè)定經(jīng)過(guò)純化之后蛋白產(chǎn)量，約2 mg/L。細(xì)胞活性測(cè)定結(jié)果可見(jiàn)，KGF-１對(duì)轉(zhuǎn)染FGFR2Ⅲb的BaF3細(xì)胞有顯著的促增殖活性，在0.1ng/ml-1.6 ng/ml呈劑量依賴關(guān)系，促細(xì)胞增殖活性優(yōu)于原核KGF-1加藥組。小鼠毛囊實(shí)驗(yàn)中，KGF-1處理組與陰性對(duì)照組相比小鼠背部皮膚變黑時(shí)間明顯縮短，與原核KGF-1給藥組組效果相當(dāng)。
　　 結(jié)論:具