雞白細(xì)胞介素18成熟蛋白在昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)中的表達(dá)及其活性檢測(cè).pdf

1、白細(xì)胞介素18（Interleukine-18，IL-18）是1995年由Okmura等從小鼠肝臟中克隆獲得的一種細(xì)胞因子，主要由單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的細(xì)胞分泌，具有強(qiáng)烈的IFN-γ誘生能力，對(duì)機(jī)體起著重要的免疫調(diào)節(jié)和保護(hù)作用，在抗微生物感染、抗腫瘤免疫中具有應(yīng)用潛力。對(duì)人和哺乳動(dòng)物IL-18的研究已有許多報(bào)道，而雞IL-18（ChIL-18）基因發(fā)現(xiàn)得比較晚，由于它具有與人和哺乳動(dòng)物相似的生物學(xué)功能，因此ChIL-18在比較免疫學(xué)研究和禽

2、病治療中具有重要意義。
　　 本實(shí)驗(yàn)室從2001年開始進(jìn)行雞白細(xì)胞介素18的研究，已經(jīng)在原核系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)了雞白細(xì)胞介素18成熟蛋白（mChIL-18）基因的高效表達(dá)，但由于該系統(tǒng)表達(dá)的蛋白存在非糖基化形式等缺陷，使得表達(dá)的蛋白分子常失去天然結(jié)構(gòu)，因而對(duì)表達(dá)的重組蛋白的活性還存在爭(zhēng)議。
　　 本試驗(yàn)利用昆蟲/桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)雞白細(xì)胞介素18成熟蛋白，進(jìn)而對(duì)該重組蛋白有效地進(jìn)行了生物學(xué)活性檢測(cè)。參考已發(fā)表的mChIL-18的c

3、DNA基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，以pMD18-T-mChIL-18質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增出編碼mChIL-18成熟蛋白基因的cDNA片段。再以桿狀病毒pFastBacTMHTb為載體，將mChIL-18基因插入到表達(dá)載體pFastBacTMHTb的多角體蛋白啟動(dòng)子PPH的下游，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pFastBacTMHTb-mChIL-18，然后將已構(gòu)建好的重組轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)座入大腸桿菌DH10BacTM感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過三次藍(lán)白斑篩選純

4、化后提取質(zhì)粒，通過一對(duì)通用引物M13（Bacmid含有該引物Forward和Reverse兩個(gè)引物位點(diǎn)，能夠從兩側(cè)擴(kuò)增LacZα互補(bǔ)區(qū)域內(nèi)的mini-attTn7位點(diǎn)，有利于PCR分析）進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，得到重組Bacmid（Bacmid-mCMIL18）。在轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin的作用下，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)法將純化的Bacmid-mChIL-18轉(zhuǎn)染至草地貪夜蛾細(xì)胞（Spodoptera frugiperda9，sf9）獲得P1代

5、重組桿狀病毒，用P1代病毒反復(fù)感染sf9來擴(kuò)增病毒滴度，將達(dá)到一定滴度（107～108pfu/mL）的重組桿狀病毒再感染sf9，并在感染后不同時(shí)間段收獲sf9細(xì)胞及培養(yǎng)上清，然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行超聲波破碎，離心后分別取裂解上清和沉淀，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析、Western blotting和間接免疫熒光（IFA）檢測(cè)，結(jié)果表明，mChIL-18基因在昆蟲細(xì)胞sf9中獲得了表達(dá)，表達(dá)的目的條帶分子量約為23KD。
　　 采用雞脾淋巴

6、細(xì)胞增殖試驗(yàn)（MTT法）、IFN-γ誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)和水皰性口炎病毒（VSV）抑制試驗(yàn)對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行生物學(xué)活性測(cè)定。
　　 雞脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)表明，mChIL-18融合蛋白能夠明顯促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖，不同濃度的蛋白均可刺激淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化。當(dāng)濃度為200ng/mL時(shí)，刺激轉(zhuǎn)化效果最佳，但隨著蛋白濃度的增大，淋巴細(xì)胞的增殖指數(shù)則會(huì)降低：VSV病毒活性抑制試驗(yàn)表明，當(dāng)?shù)鞍诐舛却笥?00ng/mL時(shí)能刺激脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，并且隨著mC