納豆激酶和hGM-CSF在家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)純化及活性研究.pdf

1、納豆激酶(nattokinase，NK)是由納豆芽孢桿菌(Bacillusnatto)或納豆枯草桿菌(Bacillussubtilisnatto)分泌的一種具有強(qiáng)烈纖溶作用的絲氨酸蛋白酶。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明該酶能顯著溶解體內(nèi)外血栓，明顯縮短纖維蛋白的溶解時(shí)間。并具有激活靜脈內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)，降解和失活纖溶酶原激活劑的抑制劑(pAI-1)和催化尿激酶原轉(zhuǎn)變成尿激酶等功能。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人體志愿者實(shí)驗(yàn)表明，納豆激酶經(jīng)口服

2、后可迅速入血，纖溶活性強(qiáng)，作用時(shí)間長(zhǎng)，具有安全性好、口服有效等優(yōu)點(diǎn)。 本研究第一部分內(nèi)容是克隆了納豆激酶基因。用PCR的方法從納豆芽孢桿菌基因組DNA中，克隆了包括編碼信號(hào)肽、前導(dǎo)肽和成熟肽序列的納豆激酶基因?；驕y(cè)序結(jié)果表明，本研究克隆的納豆激酶基因和Nakamura報(bào)道的Bacillussubtilisvar.nattosubtilisinNAT(aprN)gene(genbank登錄號(hào)：S51909)序列完全一致。

3、 本研究第二部分內(nèi)容是在大腸桿菌中表達(dá)了納豆激酶基因并制備了抗納豆激酶多克隆抗體。把納豆激酶基因克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pET28a+的BamHI和XhoI位點(diǎn)上，并在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達(dá)了納豆激酶基因。SDS-PAGE分析表明，在大腸桿菌中表達(dá)的納豆激酶融合蛋白分子量約為31kD。表達(dá)產(chǎn)物通過(guò)HiTrapTMChelatingHP親和層析柱純化。純化產(chǎn)物與弗氏佐劑混合研磨制備了乳化疫苗，皮下多點(diǎn)免疫新西蘭大白兔，制備了抗

4、納豆激酶抗體血清?？贵w血清用ProteinA親和凝膠柱純化。用瓊脂板雙向擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)初步檢測(cè)了抗體滴度。ELISA間接法測(cè)得抗體滴度大約為1∶16000，Westernblotting檢測(cè)含重組質(zhì)粒的大腸桿菌總蛋白和純化的納豆激酶融合蛋白都有一條特異的條帶。 本研究第三部分內(nèi)容是在家蠶桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)中表達(dá)了納豆激酶基因。把納豆激酶基因克隆到家蠶桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)移載體pBacPAK8的EcoRI和BamHI酶切位點(diǎn)之間，獲

5、得重組轉(zhuǎn)移載體pBacPAKNK。將重組轉(zhuǎn)移載體DNA和線性化的Bm-BacPAK6病毒DNA共轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞，通過(guò)3輪空斑篩選獲得純化的重組病毒Bm-BacPAKNK。Bm-BacPAKNK感染BmN細(xì)胞，收集不同感染時(shí)期的培養(yǎng)基和上清，SDS-PAGE和Westernblotting分析表明，納豆激酶基因在家蠶細(xì)胞中成功得到表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物是經(jīng)過(guò)剪切和修飾的去掉了信號(hào)肽和前導(dǎo)肽的28kD納豆激酶成熟肽蛋白。重組病毒Bm-BacPAKN

6、K接種五齡家蠶起蠶，每隔24h收集蠶血淋巴，待大部分蠶出現(xiàn)明顯病毒感染癥狀后大量收集蠶血淋巴。Westernblotting檢測(cè)納豆激酶在家蠶幼蟲(chóng)中得到表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物分子量在28kD左右，和納豆激酶成熟肽分子量一致。ELISA檢測(cè)結(jié)果表明：在病毒感染后120h蠶體中納豆激酶表達(dá)量最高，達(dá)40μg/ml蠶血淋巴。表達(dá)產(chǎn)物用Seizeprimaryimmunoprecipitationkit純化，純化的蛋白分子量約28kD。 本研究

7、第四部分內(nèi)容是家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的納豆激酶動(dòng)物口服實(shí)驗(yàn)。40只大鼠分為5組，設(shè)置為灌胃重組納豆激酶高、中、低劑量組，陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組。每日灌胃一次，共20d。在第10d和20d剪尾取血，用發(fā)色底物法測(cè)得灌胃納豆激酶高、中、低劑量組大鼠血液中t-PA比陰性對(duì)照組明顯增高(p＜0.01)。大鼠血漿中PAI-1濃度低于陰性對(duì)照組(p＜0.05)。提示口服家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的納豆激酶可通過(guò)激活大鼠自身的纖溶系統(tǒng)，從而達(dá)到溶栓的

8、目的。 本研究第五部分內(nèi)容是在家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)并純化了融合六個(gè)組氨酸的人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(hGM-CSF)。將融合六個(gè)組氨酸(6×his)序列的hGM-CSF基因插入桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pBacPAK8中得到桿狀病毒重組轉(zhuǎn)移載體pBacPAKHis-GM-CSF，pBacPAKHis-GM-CSFDNA與線性化病毒Bm-BacPAK6DNA共轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞，獲得了表達(dá)rhGM-CSF融合蛋白的重組病毒vBacP

9、AKHis-GM-CSF。用重組病毒感染家蠶五齡起蠶，分別在24h、48h、72h、96h、120h和144h剪腹足取蠶血淋巴，ELISA法測(cè)得rhGM-CSF融合蛋白在120h的蠶血淋巴中表達(dá)量最高，約為15μg/mL蠶血淋巴。融合蛋白通過(guò)Poly-HisProteinPurificationKit純化。SDS-PAGE和Westernblotting分析表明，表達(dá)產(chǎn)物是三種糖基化程度不同的，分子量分別約為18、20、31kD的蛋白質(zhì)