CTB-mST2融合蛋白在大腸桿菌表達(dá)及其生物活性鑒定.pdf

1、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(Escherichia Escherichia coli,ETEC)是引起人類和家畜腹瀉的主要病原菌。熱穩(wěn)定腸毒素基因(ST)是其一種毒力單位，介導(dǎo)致病?；魜y弧菌(Vibrio Cholera)是引起霍亂流行的病原茵，曾在世界范圍引起多次大的流行，死亡率很高?；魜yB亞單位無毒性，但能與大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞膜上的神經(jīng)結(jié)苷脂GM1結(jié)合，含有大部分毒素抗原的決定簇，有很強(qiáng)的抗原性，在霍亂的抗毒免疫中起重要作用。 本文利

2、用 PCR 技術(shù)分別從保存的基因質(zhì)粒中克隆出霍亂毒素 B 亞單位(CTB)和重組熱穩(wěn)定腸毒素基因(mST)。利用重疊PCR技術(shù)，通過Linker將CTB基因和串連的mST連接，得到CTB-mST2的融合基因。將所得到的基因分別插入表達(dá)載體 pET-22b(+)和 PITG-Trx，構(gòu)成表達(dá)載體 pET-CTB-mST2，pET-Trx1/ctb-st2 和 pET- Trx2/ctb-st2。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化相應(yīng)的宿主菌BL21(DE3)獲得

3、克隆，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得CTB-mST2融合蛋白。經(jīng)超聲破菌和SDS-PAGE電泳分析，目的蛋白的表達(dá)后均以包涵體的形式存在。為了得到目的蛋白的高表達(dá)量，采用多因素正交優(yōu)選法優(yōu)化了培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。多因素正交優(yōu)選法考察了 4個因素和3個水平，培養(yǎng)條件從起始誘導(dǎo)菌密度，誘導(dǎo)溫度，IPTG濃度和誘導(dǎo)時間進(jìn)行考察。最后經(jīng)搖瓶培養(yǎng)，在優(yōu)化培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件下融合蛋白表達(dá)量可達(dá)320 mg/L，占總蛋白40％。對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行包涵體復(fù)性后，經(jīng)過親合層

4、析純化得到融合蛋白，純化的融合蛋白CTB-mST2經(jīng)薄層凝膠掃描分析純度大于95％。對該融合蛋白抗原性和免疫原性進(jìn)行了分析，Western Blotting 表明CTB-mST2能與CTB抗體發(fā)生免疫反應(yīng)。融合蛋白免疫小鼠，可獲得高滴度抗CTB和ST血清；將融合蛋白與滅活的O157:H7菌體組合免疫小鼠，可產(chǎn)生對O157:H7毒株攻擊的保護(hù)力，而且呈現(xiàn)出相對于滅活O157:H7菌體單獨(dú)免疫更強(qiáng)的保護(hù)力。比本項(xiàng)研究為構(gòu)建抗ETEC和EHE