人胸腺素β4在大腸桿菌中的克隆、表達(dá)、純化及生物學(xué)活性鑒定.pdf

1、胸腺素β4是胸腺素的有效組分之一，為1981年Low等人從小牛胸腺中提取分離純化的，高度保守，由43個(gè)氨基酸組成，N端絲氨酸被乙?；?，等電點(diǎn)為5.1，具有免疫調(diào)節(jié)的功能，是一種在多種組織均有表達(dá)的蛋白多肽，在體液，血液中均存在。大量的研究表明胸腺素B4能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分化，促進(jìn)血管生成，并能促進(jìn)創(chuàng)傷的愈合和心肌梗塞時(shí)心肌細(xì)胞的存活和血管生成。胸腺素β4在治療皮膚、角膜創(chuàng)傷，治療心肌梗塞，抗腫瘤治療，抗炎等方面有著廣闊的應(yīng)用前景，目前胸腺

2、素β4在治療創(chuàng)傷、心肌梗塞等方面已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)。由于天然狀態(tài)下胸腺素β4含量稀少，從組織中純化它的成本較高；化學(xué)合成方法可以獲得，但是價(jià)格昂貴。因此，本文利用基因工程技術(shù)對(duì)胸腺素β4在大腸桿菌中的表達(dá)進(jìn)行了研究，以期為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。 (一)人胸腺素β4在原核系統(tǒng)中的克隆、表達(dá)及純化首先按照大腸桿菌密碼子嗜性對(duì)人胸腺素β4的基因序列進(jìn)行改造，用化學(xué)法合成人胸腺素β4全基因序列，PCR方法擴(kuò)增人胸腺素β4基因并在

3、其兩端引入Nde I和Xho I限制性酶切位點(diǎn)。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化DH5a，抽提質(zhì)粒，測(cè)序鑒定，把序列正確質(zhì)粒上的胸腺素β4基因亞克隆至原核表達(dá)載體pTXB1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌ER2566，在IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)的融合蛋白約占菌體蛋白總量的50％，經(jīng)過(guò)超聲裂解，親和層析，柱上裂解釋放目的蛋白，超濾，脫鹽等處理得到重組人胸腺素β4純品。純化的胸腺素β4經(jīng)Tricine-SDS-PAGE電泳分析只有一條帶，純度在90

4、％以上。 (二)人胸腺素β4蛋白理化特性的研究用Edman降解法對(duì)重組人胸腺素β4純品N端5個(gè)氨基酸測(cè)定，測(cè)序結(jié)果顯示重組蛋白的N端5個(gè)氨基酸為SDKPD，與天然胸腺素β4的一致；用ABI公司質(zhì)譜儀對(duì)重組蛋白分析，分析結(jié)果顯示重組蛋白具有預(yù)期的分子量，胰蛋白酶酶切肽譜測(cè)定結(jié)果顯示肽質(zhì)量圖譜匹配良好，這些結(jié)果表明重組蛋白就是人胸腺素β4。 (三)人胸腺素β4生物學(xué)活性檢測(cè)人胸腺素β4具有免疫調(diào)節(jié)的作用。參照相關(guān)文獻(xiàn)，用淋巴

5、細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)重組蛋白的生物學(xué)活性。本研究首先優(yōu)化了刀豆素A的最佳刺激濃度，選用終濃度4ug/ml的刀豆素A刺激淋巴細(xì)胞6小時(shí)，然后加入不同濃度的重組人胸腺素β4繼續(xù)培養(yǎng)至72小時(shí)，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖。與化學(xué)合成的人胸腺素β4相比，重組人胸腺素β4具有相當(dāng)?shù)纳飳W(xué)活性。 (四)人胸腺素β4在創(chuàng)傷愈合中的促進(jìn)作用參照相關(guān)文獻(xiàn)，在Balb/c小鼠身上制造皮膚創(chuàng)傷模型，局部使用重組人胸腺素β4，組織學(xué)檢測(cè)表明重組人胸腺素β4