幽門螺桿菌融合蛋白UreB-Omp11在大腸桿菌中的表達(dá)與鑒定.pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，Hp)感染是世界上最常見的感染之一，目前Hp已經(jīng)成為公認(rèn)的人類慢性活動性胃炎和消化性潰瘍的主要致病因子，并與胃癌、胃MALT惡性淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)。目前，臨床上主要采用抗生素治療Hp的感染，短期內(nèi)雖有較好的療效，但由于存在細(xì)菌耐藥性不斷增加、治療費用高、不能防止復(fù)發(fā)和重復(fù)感染等問題，使這類方案的實用性受限。疫苗接種經(jīng)濟而簡便，可在人群中大規(guī)模運用，并且對耐藥細(xì)菌仍然有效，因此研究幽門螺

2、桿菌疫苗有重要意義。 雖然Hp疫苗研究取得了一定成績，但一直令學(xué)者們遺憾的是單一抗原成分免疫動物時，獲得的保護率均不理想，為了克服單種抗原免疫性較弱的不足有學(xué)者建議將多種抗原成分聯(lián)合起來制作疫苗。這就為今后Hp疫苗的探索和研究指出了發(fā)展方向。 國內(nèi)外大量研究證實UreB有較好的免疫保護效果，而且已有研究將UreB疫苗制劑進入到二期臨床試驗，證實Hp尿素酶在人體有效。已有研究結(jié)果顯示Hp外膜蛋白中有些具有良好的免疫學(xué)活性，

3、Omp11是Hp的一種外膜蛋白，其編碼基因具有高度保守性，經(jīng)動物實驗鑒定亦取得了較好的免疫保護效果，為重要的免疫抗原。 因此，為了取得更好的免疫效果，用重疊延伸PCR法獲得ureB-omp11融合基因(含編碼甘氨酸絲氨酸Gly3Ser2(G-S-G-G-S)的堿基序列)，并通過設(shè)計合適的酶切位點，將融合蛋白插入原核表達(dá)載體中，使之高效表達(dá)融合蛋白UreB-Omp11，用Westernblot法鑒定其免疫學(xué)活性，并用Amylose

4、親和層析法純化融合蛋白，為Hp聯(lián)合抗原基因工程疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。 目的： 構(gòu)建幽門螺桿菌UreB-Omp11融合蛋白重組疫苗候選株，為Hp聯(lián)合抗原基因工程疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。 方法： 1幽門螺桿菌ureB-omp11融合基因的克隆與序列分析 應(yīng)用PCR的方法以本研究室所構(gòu)建的重組載體pET30a(+)-hspA-ureB、pMAL-c2X-omp11為模板擴增UreB、Omp11編碼基因(含編碼

5、甘氨酸絲氨酸Gly3Ser2(G-S-G-G-S)的堿基序列)，并用重疊延伸PCR法獲得融合基因ureB-omp11(中間帶有編碼甘氨酸絲氨酸Gly3Ser2(G-S-G-G-S)的堿基序列)，將融合基因ureB-omp11插入載體pET30a(+)中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)卡那霉素抗性和菌落PCR篩選陽性克隆，用小提質(zhì)粒酶切電泳和特異PCR方法鑒定重組質(zhì)粒。對重組質(zhì)粒進行基因序列測定，并通過DNAsis2.5軟件進行核苷酸和氨基酸序

6、列分析。利用生物學(xué)軟件Omiga2.0對MEL-HP27的UreB-Omp11融合蛋白的二級結(jié)構(gòu)以及抗原性、親水性進行模擬分析。 2HpUreB-Omp11融合蛋白原核表達(dá)系統(tǒng)的篩選及純化 將融合基因ureB-omp11插入原核表達(dá)載體pET30a(+)、pET28a(+)以及pMAL-c2X中，轉(zhuǎn)化合適的大腸桿菌，篩選并鑒定重組質(zhì)粒。攜帶重組質(zhì)粒的大腸桿菌經(jīng)誘導(dǎo)，進行SDS-PAGE電泳，觀察有無目的蛋白表達(dá)，并與Hp

7、(+)病人血清進行Westernblot分析，鑒定UreB-Omp11融合蛋白的免疫學(xué)活性。 利用Amylose預(yù)裝柱純化UreB-Omp11融合蛋白并進行SDS-PAGE電泳分析。 結(jié)果： 1幽門螺桿菌ureB-omp11融合基因的克隆與序列分析結(jié)果 含ureB-omp11融合基因的重組質(zhì)粒pET30a(+)-ureB-omp11，經(jīng)酶切后得到載體片段(5.4kb)和目的基因ureB-omp11融合基因

8、片段(2.3kb)，特異PCR可擴增出2.3kb的ureB-omp11融合基因片段，證實pET30a(+)-ureB-omp11重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。測序結(jié)果進一步證明用重疊延伸PCR法成功融合了ureB、omp11，并成功加入了編碼彈性蛋白連接肽即5個氨基酸的疏水性多肽Gly3Ser2(G-S-G-G-S)的堿基序列。利用生物學(xué)軟件DNAsis2.5對HpMEL-HP27融合基因ureB-omp11進行核苷酸和氨基酸的序列分析，融合基因全

9、長2280bp，編碼有760個氨基酸殘基組成的肽鏈。利用生物學(xué)軟件Omiga2.0對HpMEL-HP27融合蛋白UreB-Omp11融合前后的二級結(jié)構(gòu)以及融合蛋白的抗原性、親水性進行分析，可見重組蛋白融合前后二級結(jié)構(gòu)相似；融合蛋白的氨基酸殘基多數(shù)為親水性集團，與抗原性分布相吻合，并且UreB和Omp11的抗原活性中心在融合蛋白UreB-Omp11中未發(fā)生變化。 2幽門螺桿菌UreB-Omp11融合蛋白原核表達(dá)系統(tǒng)的篩選及純化

10、 本研究成功構(gòu)建了三個表達(dá)HpUreB-Omp11融合蛋白的原核表達(dá)系統(tǒng)，即帶有重組質(zhì)粒pET30a(+)-ureB-omp11的大腸桿菌BL21(DE3)、帶有重組質(zhì)粒pET28a(+)-ureB-omp11的大腸桿菌BL21(DE3)、和帶有重組質(zhì)粒pMAL-c2X-ureB-omp11的大腸桿菌TB1。 BL21(pET-30a(+)-ureB-omp11)和BL21(pET-28a(+)-ureB-omp11)經(jīng)IP

11、TG誘導(dǎo)后均未見到目的蛋白表達(dá)。TB1(pMAL-c2X-ureB-omp11)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，在相對分子量134kDa處出現(xiàn)一條特異帶，正好是標(biāo)簽蛋白-MBP(相對分子量42.5kDa)與UreB-Omp11的相對分子量(91.5kDa其中UreB63.5kDa、Omp1128kDa)的總和，與預(yù)期融合蛋白相對分子量相符，約占全菌蛋白的25％，且可以被Hp(+)病人血清識別。因此選定TB1(pMAL-c2

12、X-ureB-omp11)系統(tǒng)作為UreB-Omp11融合蛋白的表達(dá)系統(tǒng)。 利用Amylose預(yù)裝柱純化UreB-Omp11融合蛋白，達(dá)到一步純化，融合蛋白純度可達(dá)到約90％。 結(jié)論： 1成功獲得了ureB-omp11融合基因，并以編碼彈性蛋白連接肽即甘氨酸、絲氨酸Gly3Ser2(G-S-G-G-S)的堿基序列為接頭，使UreB、Omp11保持其原有的抗原活性中心和生物學(xué)活性； 2將ureB-omp11