KGF-2結(jié)構(gòu)與功能的研究.pdf

1、該實(shí)驗(yàn)利用計(jì)算機(jī)分子模擬系統(tǒng)對(duì)KGF-2與FGFR2IIIb結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行了分析,同時(shí)綜合同源序列的比較結(jié)果,設(shè)計(jì)并構(gòu)建了五個(gè)KGF-2突變體:AGBH、T114A、T114R、G160H和LY.首先,利用PCR方法克隆了人KGF-2成熟肽的cDNA序列,并以此cDNA為模板,利用重疊延伸PCR方法構(gòu)建了各突變體的編碼DNA序列.然后,將它們分別插入pET-17b載體中,利用E.coli BL21進(jìn)行了表達(dá),結(jié)果表明重組KGF-2及

2、其各突變體的表達(dá)量在13﹪30﹪之間,主要以可溶性形式表達(dá).利用陽(yáng)離子交換柱對(duì)它們進(jìn)行純化,純度可達(dá)90﹪以上.分別利用競(jìng)爭(zhēng)性ELISA和MTT法進(jìn)行的受體親合力和對(duì)RTE細(xì)胞生長(zhǎng)作用的檢測(cè)結(jié)果表明,標(biāo)準(zhǔn)品、重組KGF-2及其突變體均能夠促進(jìn)RTE細(xì)胞的增殖,并且作用效果表現(xiàn)出明顯的劑量依賴特性;重組KGF-2與標(biāo)準(zhǔn)品的受體親合力和促增殖作用基本一致;與重組KGF-2相比,LY的受體親合力和促增殖活性都顯著增加,AGBH的受體親合力稍有

3、增加,但促增殖活性顯著增加,T114A的受體親合力基本不變,但促細(xì)胞增殖活性顯著下降,T114R和G160H的受體親合力和促細(xì)胞增殖活性都顯著下降.上述結(jié)果表明,Thr114、A、B、Gly160和L都是KGF-2重要的FGFR2Ⅲb結(jié)合位點(diǎn)及活性位點(diǎn),它們的改變對(duì)KGF-2的受體親合力和活性影響很大.同時(shí),AGBH和T114A在受體親合力沒(méi)有很大改變的情況下,促細(xì)胞增殖活性卻發(fā)生了極大變化,表明Thr114、A和B對(duì)KGF-2激活受體

4、至關(guān)重要.利用SGI Origin 300圖形工作站和BIOSYM/MSI分子模擬系統(tǒng),模建了各突變體的結(jié)構(gòu).對(duì)突變前后各突變位點(diǎn)氨基酸殘基與受體相互作用的分析結(jié)果表明,受體親和力的改變是所有發(fā)生變化的作用力相互抵消和均衡的結(jié)果,并不取決于某單一作用力的改變.利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選到兩個(gè)與KGF-2有相互作用的蛋白質(zhì),分別是PR02605和RPL22,但進(jìn)一步利用哺乳動(dòng)物雙雜交系統(tǒng)只檢測(cè)到RPL22與KGF-2在COS7細(xì)胞中的相互作用