骨骼肌損傷修復過程中細胞去分化現(xiàn)象的初步研究.pdf

1、再生醫(yī)學領域中,因干細胞具有多分化潛能和自我更新能力的生物學特征,其在修復再生過程的作用,受到越來越多的關注[1,2]。目前存在的問題是:獲取人類的胚胎干細胞不僅對胚胎組織是種損傷性的操作,更是受到倫理道德規(guī)范的束縛。成熟細胞去分化在哺乳動物再生中的作用一直存在爭議。在低等動物中,再生過程中細胞去分化是有機體長期進化過程中獲得的一種保護性和適應性現(xiàn)象,可以控制并且有限增殖。在低等動物(如蠑螈)機體損傷修復過程中,其體內(nèi)存在著強大的細胞去

2、分化能力,這一機體組織再生的理論已經(jīng)被廣泛接受和普遍認可[3]；由于哺乳動物的組織器官在損傷修復的再生過程中,很大程度上受其局部環(huán)境(如炎癥細胞的作用)和機體整體環(huán)境(如免疫系統(tǒng)的破壞)因素的影響,一般認為人類等哺乳動物的細胞去分化能力是相對低下的[4]。去分化在哺乳動物組織損傷修復中的作用已經(jīng)逐步受到國內(nèi)外學者的重視。然而,在組織細胞損傷修復過程中,去分化現(xiàn)象觀察方法的建立,細胞去分化與凋亡之間的相互聯(lián)系等問題都有待進一步深入研究。鑒

3、于此,我們建立大鼠的肌肉損傷模型,觀察肌肉損傷修復過程中組織形態(tài)學的變化,試圖從形態(tài)學角度觀察細胞去分化現(xiàn)象,并探討細胞去分化與細胞凋亡之間可能存在的某種聯(lián)系。
　　 是否存在某種途徑使得成體細胞轉化為類干細胞狀態(tài)呢?Chen等人應用人工合成的化學物質(zhì)“Reversine”(2-(4-morpholinoanilino)-6-cyclohexylaminopurine)成功誘導已分化成熟的細胞去分化返回到干細胞[5]。Rever

4、sine能使C2C12細胞去分化至“類干細胞”。這些“類干細胞”在不同的條件下,又分別能被誘導成為成骨細胞和脂肪細胞。已經(jīng)有學者開始利用分子生物學等技術去探索Reversine誘導去分化發(fā)生的作用機理[6,7]。但關于Reversine在誘導去分化過程中對細胞增殖分化究竟是如何影響的,卻鮮見報道。為此我們以體外培養(yǎng)的C2C12小鼠成肌細胞為研究對象,分析Reversine對C2C12成肌細胞生長的影響,以明確Reversine在誘導去分

5、化過程中對成肌細胞狀態(tài)和功能的作用。
　　 [目的]
　　 1 觀察骨骼肌細胞損傷修復過程中骨骼肌細胞形態(tài)學變化；
　　 2 初步探討Reversine對小鼠C2C12成肌細胞生長的影響。
　　 [方法]
　　 1制作SD大鼠下肢腓腸肌肌肉損傷修復模型,術后27d在損傷處取材進行形態(tài)學觀察。
　　 1.1 通過透射電鏡對肌肉組織損傷修復細胞去分化現(xiàn)象進行觀察；
　　 1.2 通過H

6、E染色和免疫熒光染色觀察骨骼肌細胞組織形態(tài)學變化。
　　 2 C2C12小鼠成肌細胞系的體外培養(yǎng),分組處理。
　　 2.1 將C2C12小鼠成肌細胞分三組:A組:正常對照組,B組:1μM Reversine處理12h組,C組:1μM Reversine處理24h組。上述三組用Annexin-V/PI雙染法處理,并通過流式細胞技術檢測三組C2C12細胞凋亡比例的差異；
　　 2.2 將C2C12小鼠成肌細胞分五組:

7、A組:正常對照組,B組:單獨1μM Reversine處理7d,C組:不加Reversine處理,單獨成骨誘導7d,D組:1μM Reversine誘導12h+單獨成骨誘導7d,E組:1μM Reversine誘導12h+1μM Reversine聯(lián)合成骨誘導7d。上述五組光鏡下觀察細胞形態(tài)的變化,并通過逆轉錄聚合酶鏈反應(R.T-PCR)法檢測五組C2C12成肌細胞分化抑制因子(Id2),肌肉發(fā)生調(diào)節(jié)因子(Myogenin),生肌因子

8、后結蛋白(Desmin)mRNA的表達。
　　 [結果]
　　 1 電鏡觀察:損傷后的肌纖維溶解,并出現(xiàn)原始幼稚的細胞；
　　 2 HE染色觀察:與正常組織細胞相比,損傷處的組織細胞排列紊亂,細胞核大量聚集,且由多核細胞變成了單核細胞；
　　 3 免疫熒光染色:正常骨骼肌AIF未見表達,損傷后的骨骼肌細胞中可見AIF明顯表達于細胞核內(nèi)；
　　 4 流式細胞術檢測結果:與正常對照組相比,1μM Re

9、versine處理24h能引起C2C12細胞顯著的凋亡,1μM Reversine處理12h的C2C12細胞未見顯著的凋亡；
　　 5 Reversine處理后細胞形態(tài)學觀察結果:與正常對照組相比,單獨Reversine處理組和1μM Reversine處理12h后再聯(lián)合成骨誘導組的細胞增殖明顯受到抑制,單獨誘導組和1μM Reversine處理12h后再單獨誘導組細胞逐漸增殖并融合；
　　 6 Reversine處理后

10、RT-PCR結果:與正常對照組相比,1μM Reversine 12h的培養(yǎng)條件下,Id2表達顯著增強,且有統(tǒng)計學差異,表明對Reversine耐受細胞的細胞增殖能力顯著增強；同時,1μM Reversine 12h的培養(yǎng)條件下,Myogenin和Desmin兩者所表達的趨勢基本一致,表達顯著減弱,有統(tǒng)計學差異,表明對Reversine耐受細胞的細胞成肌分化能力顯著減弱,細胞生長受到抑制。
　　 [結論]
　　 1 骨骼