大鼠骨骼肌挫傷愈合過(guò)程中α7nAChR的時(shí)間規(guī)律性表達(dá)及肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖、分化的研究.pdf

1、目的：
　　本實(shí)驗(yàn)旨在研究:(1)α7nAChR在骨骼肌損傷愈合過(guò)程中的時(shí)間規(guī)律性表達(dá)，鑒別表達(dá)α7nAChR的細(xì)胞類(lèi)型;(2) Pax7和MyoD在骨骼肌損傷愈合過(guò)程中的時(shí)間表達(dá)規(guī)律，通過(guò)Pax7和MyoD的免疫熒光共定位鑒定肌衛(wèi)星細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化。
　　材料與方法：
　　一、骨骼肌挫傷動(dòng)物模型的建立
　　健康的成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠45只，體重280～300g，隨機(jī)分為9組，每組5只，

2、其中8組為實(shí)驗(yàn)組，1組為正常對(duì)照組。大鼠骨骼肌挫傷模型的標(biāo)準(zhǔn)化建立參照Kami、于天水等人所描述的，即實(shí)驗(yàn)組大鼠通過(guò)腹腔注射2％戊巴比妥鈉(30mg/kg)的方式麻醉后，大鼠右后肢剃毛備皮。然后，將大鼠右后肢置于伸膝、踝背屈90°位置，利用自制機(jī)械性打擊器，使重500克的擊錘以3m/s的速度垂直打擊大鼠右后肢距跟骨2.5cm處，打擊處做好標(biāo)記。損傷后每只大鼠單獨(dú)飼養(yǎng)，保持墊料清潔及空氣通暢，給予實(shí)驗(yàn)室清潔飼料及充足的水，并維持12小時(shí)日

3、夜節(jié)律。分別于損傷后1d，3d，5d，7d，9d，13d,17d，21d向大鼠腹腔內(nèi)注射致死劑量的戊巴比妥鈉處死大鼠，參照我們課題組師兄等人的取材方式，取挫傷處骨骼肌樣本，并等分為兩部分。一部分用于形態(tài)學(xué)分析，另一部分用于Westernblot和real-time PCR檢測(cè)。正常對(duì)照組5只大鼠麻醉后背部剪毛，不做挫傷，觀(guān)察至21d，采用與實(shí)驗(yàn)組相同處死方式和取材方式操作。取材過(guò)程中未發(fā)現(xiàn)骨折的現(xiàn)象存在。
　　二、組織化學(xué)和免疫組

4、織化學(xué)染色
　　骨骼肌樣本經(jīng)4％多聚甲醛(pH7.4)固定24h，脫水，透明，包埋在石蠟中，制作5μm厚度連續(xù)切片，進(jìn)行HE染色及α7nAChR的免疫組織化學(xué)染色。針對(duì)免疫組織化學(xué)染色，顯微鏡×400視野下，在每張切片的損傷區(qū)隨機(jī)選擇5個(gè)視野，應(yīng)用Image Pro plus6.0圖像分析軟件，以積分光密度(integral optical density，IOD)白顆粒密度，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞率。所有的測(cè)量和數(shù)據(jù)分析均采用雙盲法進(jìn)行。

5、
　　三、免疫熒光染色
　　石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，進(jìn)行α7nAChR/MPO，α7nAC hR/MAC387,α7nAC hR/α-SMA,α7nAChR/Pax7,α7nAChR/MyoD,α7nAChR/Myogenin以及Pax7/MyoD之間的雙重免疫熒光的共定位。Hoechst33258常規(guī)染核。用PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。
　　四、Western Blot檢測(cè)α7nAChR、Pax7及MyoD蛋白

6、　　提取樣本總蛋白，上樣量為30μg。轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，用8％脫脂奶粉封閉后，分別用兔抗大鼠α7nAChR多克隆抗體(1∶1000)、兔抗大鼠Pax7多克隆抗體(1∶400)、小鼠抗大鼠MyoD單克隆抗體(1∶200)以及小鼠抗大鼠GAPDH單克隆抗體(1∶3000)4℃孵育過(guò)夜，分別用相應(yīng)的二抗室溫孵育，ECL發(fā)光，經(jīng)電泳凝膠成像分析系統(tǒng)掃描，用Scion Image軟件檢測(cè)目的蛋白條帶灰度值與GAPDH灰度值，兩者比值為其相對(duì)表達(dá)

7、量。
　　五、RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)
　　參照RNAiso Plus試劑盒說(shuō)明書(shū)提取骨骼肌樣本的總RNA。應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定每個(gè)RNA樣本的OD值。A260/A280的比值在1.8至2.0之間為宜。將提取的總RNA參照PrimeScriptTM RT reagent Kit(RR037A, Takara Biotechnology,Shiga，Japan)說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。產(chǎn)生

8、的cDNA用于α7nAChR、Pαx7、Myod1及Gapdh的real-time PCR檢測(cè)。應(yīng)用SYBR(R) PrimeScriptTM RT-PCR Kit(RR081A,Takara Biotechnology, Shiga, Japan)試劑盒通過(guò)Applied Biosystems7500 Real-TimePCR系統(tǒng)操作real-time PCR，至少重復(fù)3次。用雙蒸水替代cDNA作為陰性對(duì)照。
　　六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

9、
　　數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(X)±SD）表示，并應(yīng)用PRISM6.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。以p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　一、損傷后形態(tài)學(xué)改變
　　骨骼肌挫傷后，檢見(jiàn)出血、水腫及變性。挫傷后1天，挫傷區(qū)大量多形核細(xì)胞(polymorphonuclear cells，PMNs)浸潤(rùn)。少量圓形的單核細(xì)胞(mononuclear cells，MNCs)在傷后1天出現(xiàn)，在挫傷后3天其數(shù)量明顯

10、增加。傷后3天，挫傷區(qū)出現(xiàn)紡錘形的成纖維細(xì)胞(fibroblastic cells， FBCs)。挫傷后5～9天，在挫傷區(qū)檢見(jiàn)大量FBCs，并伴隨新生多核肌管的出現(xiàn)。挫傷后13～21天，趨于減少的FBCs和逐漸成熟的肌管以及瘢痕組織在挫傷區(qū)被觀(guān)察到。
　　二、免疫組織化學(xué)染色
　　在正常骨骼肌，肌膜和肌漿顯示α7 nAC hR的弱陽(yáng)性反應(yīng)。骨骼肌挫傷后1天，可見(jiàn)挫傷區(qū)大量PMNs表達(dá)α7nAChR。傷后3天α7nAChR表達(dá)

11、以MNCs為主，在出現(xiàn)的少量的FBCs也表達(dá)α7nAChR。傷后5～13天，α7nAChR陽(yáng)性免疫反應(yīng)以FBCs和新生多核肌管為主。傷后17～21天，隨著新生肌管趨于成熟，α7nAC hR的陽(yáng)性強(qiáng)度也逐漸減弱;此時(shí)挫傷區(qū)的FBCs的數(shù)量減少和體積減小，但仍表達(dá)α7nAC hR。α7nAChR陽(yáng)性細(xì)胞率隨著損傷時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，于挫傷后9天達(dá)到高峰，隨后逐漸下降。
　　三、免疫熒光染色
　　1.雙重免疫熒光鑒定表達(dá)α7nAC

12、hR的細(xì)胞類(lèi)型
　　在大鼠骨骼肌挫傷愈合過(guò)程中，α7nAChR時(shí)序性表達(dá)于中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞。
　　對(duì)于骨骼肌新生而言，肌衛(wèi)星細(xì)胞是其再生干細(xì)胞，激活后該細(xì)胞在生肌過(guò)程中的定位是:Pax7+細(xì)胞:肌衛(wèi)星細(xì)胞靜止期和/或激活期;MyoD+細(xì)胞:肌衛(wèi)星細(xì)胞激活期和/或分化期;Myo genin+細(xì)胞:肌衛(wèi)星細(xì)胞分化期和新生多核肌管。
　　在正常骨骼肌，α7nAC hR+/Pax7+細(xì)胞數(shù)量極少，骨骼肌挫傷后

13、3天α7nAC hR+/Pax7+細(xì)胞數(shù)量明顯增加，于傷后5天達(dá)到高峰，隨后數(shù)量逐漸減少。
　　骨骼肌挫傷后1天，α7nAC hR+/Myo D+細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)，傷后3天α7nAChR+/MyoD+細(xì)胞數(shù)量急劇增加，陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)串珠狀排列;傷后5天，陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)以新生多核肌管為主，仍有串珠樣陽(yáng)性細(xì)胞，α7nAC hR+/MyoD+細(xì)胞數(shù)量達(dá)頂峰;隨著損傷時(shí)間延長(zhǎng)，新生多核肌管逐漸成熟，α7nAChR和MyoD的表達(dá)強(qiáng)度均逐漸減弱

14、。
　　骨骼肌損傷后1～3天，α7 nAC hR+/Myo genin+細(xì)胞表達(dá)情況與α7nAChR+/MyoD+細(xì)胞基本相似;傷后5天，α7 nAChR+/Myogenin細(xì)胞形態(tài)以新生肌管為主，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目達(dá)高峰，且Myogenin在新生肌管的陽(yáng)性強(qiáng)度高于MyoD;隨著損傷時(shí)間延長(zhǎng)，新生多核肌管逐漸成熟，新生肌管細(xì)胞核從中央開(kāi)始邊聚，Myogenin的陽(yáng)性強(qiáng)度也隨之減弱，同時(shí)，α7nAChR表達(dá)強(qiáng)度的變化與Myogenin基本

15、同步。
　　2.雙重免疫熒光鑒定肌衛(wèi)星細(xì)胞的時(shí)間動(dòng)態(tài)性
　　正常骨骼肌，僅有極少量的Pax7+/MyoD-細(xì)胞;骨骼肌挫傷后3天，Pax7+/MyoD-細(xì)胞與Pax7-/MyoD細(xì)胞數(shù)目均明顯升高，Pax7+/MyoD+細(xì)胞數(shù)量隨之增加;傷后5天，處于3種生肌狀態(tài)下肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量達(dá)到高峰;隨著骨骼肌損傷時(shí)間的延長(zhǎng)，處于3種生肌狀態(tài)下肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量也隨之逐漸下降，需指出的是，MyoD+細(xì)胞從傷后5天開(kāi)始以新生肌管為主，隨著新生

16、多核肌管的逐漸成熟，其陽(yáng)性強(qiáng)度明顯降低。
　　四、Western blot檢測(cè)和real-time PCR檢測(cè)
　　觀(guān)察大鼠正常骨骼肌和挫傷組α7nAChR、 Pax7及MyoD蛋白和其各自mRNA的相對(duì)表達(dá)。骨骼肌挫傷后各時(shí)間段上述3種蛋白和其各自mRNA變化規(guī)律基本一致。與正常組相比，傷后1天α7nAChR、Pax7及MyoD蛋白和其各自mRNA水平開(kāi)始升高，分別于損傷后9天、5天和5天達(dá)到高峰，但須指出，MyoD的mR

17、NA水平在傷后3天達(dá)到高峰，隨后均逐漸降低。
　　結(jié)論:
　　1、大鼠骨骼肌挫傷愈合過(guò)程中，中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及肌成纖維細(xì)胞表達(dá)α7nAChR，提示α7nAChR可能參與調(diào)節(jié)骨骼肌挫傷過(guò)程中的炎癥、纖維化。
　　2、大鼠骨骼肌挫傷愈合過(guò)程中，從靜止期肌衛(wèi)星細(xì)胞至新生多核肌管均表達(dá)α7nAChR，提示α7nAChR可能參與調(diào)節(jié)肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖、分化并融合為肌管的新生過(guò)程。
　　3、大鼠骨骼肌挫傷愈合過(guò)程中，肌衛(wèi)星