FHL2基因在雞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖與分化中的作用研究.pdf

1、FHL2(Four and a Half LIM protein2)屬于FHL蛋白家族的成員，是一種只含有四個(gè)半LIM結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。已有研究表明，F(xiàn)HL2直接或間接參與調(diào)控衛(wèi)星細(xì)胞增值與分化相關(guān)重要通路（Wnt/β-catenin、TGFβ）的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，且該基因在雞出生后不同階段的胸肌中表達(dá)呈現(xiàn)顯著差異，推測(cè)FHL2基因可能為調(diào)控雞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化的重要因子。因此，本研究通過(guò)對(duì)體外培養(yǎng)的原代雞胸肌衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)行FHL2 SiR

2、NA的轉(zhuǎn)染處理，觀察對(duì)轉(zhuǎn)染不同時(shí)間點(diǎn)(12h、24h、48h和72h)的肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖與分化形態(tài)，并通過(guò)RT-PCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后(12h、24h和48h)相關(guān)成肌調(diào)節(jié)因子以及Wnt/β-catenin、TGFβ、Notch三條重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)鍵基因的mRNA表達(dá)，以及采用Western-Blot檢測(cè)了FHL2、MYH7B以及NUMB蛋白在轉(zhuǎn)染后(24h、48h和72h)的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果表明:
　　(1)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化:轉(zhuǎn)

3、染后12h，三個(gè)試驗(yàn)組細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上沒(méi)有明顯的差異;24h后，處理組的衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量明顯少于兩個(gè)對(duì)照組，對(duì)照組細(xì)胞極少部分出現(xiàn)分化;48h后，兩個(gè)對(duì)照組細(xì)胞長(zhǎng)滿且大量分化，而處理組細(xì)胞少量增殖且僅有極少數(shù)細(xì)胞開(kāi)始分化;72h后，兩個(gè)對(duì)照組完全分化且出現(xiàn)肌管，而處理組的細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯變化，部分細(xì)胞開(kāi)始分化，但無(wú)肌管出現(xiàn)。
　　(2)成肌調(diào)節(jié)因子的mRNA表達(dá):在轉(zhuǎn)染12h和24h后，處理組中FHL2的mRNA表達(dá)顯著低于兩個(gè)對(duì)照組(P

4、＜0.05);轉(zhuǎn)染后12h，處理組中成肌調(diào)節(jié)因子MyoD和MyoG的mRNA表達(dá)量顯著低于兩個(gè)對(duì)照組(P＜0.05);轉(zhuǎn)染后24h，處理組中MyoG和MYHC的mRNA表達(dá)量顯著低于兩個(gè)對(duì)照組(P＜0.05);三個(gè)試驗(yàn)組中MRF4的表達(dá)量在轉(zhuǎn)染后的三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均差異不顯著(P＞0.05)
　　(3) Notch信號(hào)通路:轉(zhuǎn)染12h后，處理組中hairy1的mRNA表達(dá)量顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P＜0.05);轉(zhuǎn)染24h后，處

5、理組中Notch2、Hey1以及hairy1的mRNA表達(dá)量顯著或極顯著低于對(duì)照組(P＜0.05或P＜0.01);轉(zhuǎn)染48h后，處理組中NUMB的mRNA表達(dá)量極顯著低于另兩個(gè)組(P＜0.01);
　　(4) TGFβ信號(hào)通路:關(guān)鍵基因ACVR1的mRNA表達(dá)量在轉(zhuǎn)染12h時(shí)處理組顯著低于兩個(gè)對(duì)照組(P＜0.05);ACVR2的mRNA表達(dá)量則在轉(zhuǎn)染后三個(gè)時(shí)間點(diǎn)中均為處理組顯著低于兩個(gè)對(duì)照組(P＜0.05);
　　(5) W

6、nt/β-catenin信號(hào)通路:轉(zhuǎn)染12h后，處理組中β-catenin、Wnt2b以及Wnt4的mRNA表達(dá)量顯著或極顯著低于對(duì)照組(P＜0.05或P＜0.01);轉(zhuǎn)染24h后，處理組中Wnt4和Wnt6的mRNA表達(dá)量極顯著低于對(duì)照組(P＜0.01);轉(zhuǎn)染48h后，處理組中GSK3β和Wnt5a的mRNA表達(dá)量極顯著低于對(duì)照組(P＜0.01)。
　　(6) Western-Blot檢測(cè)表明:轉(zhuǎn)染48h后，處理組中FHL2蛋白

7、和MYH7B蛋白的表達(dá)量明顯低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組;在轉(zhuǎn)染72h后，處理組中NUMB蛋白的表達(dá)量明顯低于兩個(gè)對(duì)照組。
　　綜上，轉(zhuǎn)染FHL2 SiRNA后，雞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和分化均受到明顯的抑制，F(xiàn)HL2的表達(dá)量降低下調(diào)部分成肌因子的表達(dá)，Wnt/β-catenin、TGFβ、Notch三條通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)也受到不同程度的抑制。因此，本研究推測(cè)FHL2基因可能通過(guò)Wnt/β-catenin、TGFβ、Notch三條通路的信