1、GEP蛋白在骨骼肌分化過(guò)程中的功能研究;2、ADAMTS-12抑制軟骨分化的功能研究.pdf

1、GEP（granulin-epithelin precursor）蛋白是一種自分泌生長(zhǎng)因子，也被稱(chēng)為progranulin，proepithelin，acrogranin或者PC細(xì)胞衍生生長(zhǎng)因子，是一個(gè)68．5-kDa大小的分泌性生長(zhǎng)因子。它的序列高度保守，幾乎在所有真核生物中均表達(dá)。該蛋白高度糖基化，在SDS-PAGE上呈現(xiàn)為分子量大小約90-kDa。結(jié)構(gòu)上，它屬于生長(zhǎng)因子家族。GEP可以以完整蛋白形式分泌，或者被蛋白水解，以多肽的形

2、式分泌，即組成GEP蛋白的多肽片段-顆粒體蛋白（granulin）。GEP蛋白作為一種具有較大分子量的自分泌生長(zhǎng)因子，參與多種生理性和病理性過(guò)程。GEP蛋白在代謝較快的上皮細(xì)胞，免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞中豐富表達(dá)。同時(shí)，在人類(lèi)幾種癌組織中也有報(bào)道GEP蛋白高度表達(dá)，有理由相信，GEP蛋白會(huì)導(dǎo)致乳腺癌，透明細(xì)胞腎癌，侵襲性卵巢癌，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，脂肪畸胎瘤，多發(fā)性骨髓瘤和骨肉瘤。同時(shí)，越來(lái)越多的證據(jù)表明GEP蛋白也參與分化、發(fā)育和病理過(guò)

3、程中的調(diào)節(jié)。 本文主要研究GEP蛋白在骨骼肌分化中的作用和機(jī)制。骨骼肌分化過(guò)程是受一些轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)控的（成肌因子家族），包括MyoD，Myf5，myogenin和MRF4。成肌因子在肌分化過(guò)程中起著重要的作用，如果在任何非成肌細(xì)胞（例如10T1/2成纖維細(xì)胞）中異位表達(dá)這些成肌因子，將會(huì)導(dǎo)致多種肌分化基因的表達(dá)，促使其向肌管分化。本研究以GEP蛋白為主要研究對(duì)象，系統(tǒng)的探討了GEP蛋白在成肌細(xì)胞分化中的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制，首次揭示了

4、GEP蛋白在成肌細(xì)胞分化中的調(diào)節(jié)作用及其相應(yīng)的分子機(jī)制： 1．我們利用免疫組織化學(xué)染色的方法，顯示GEP蛋白在胚胎肌肉組織中表達(dá)，應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，證明GEP在C2C12細(xì)胞向肌管分化過(guò)程中，GEP表達(dá)量是增高的，無(wú)論是mRNA水平還是蛋白水平。提示GEP在調(diào)節(jié)骨骼肌分化中起作用。 2．應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，證明MyoD可以誘導(dǎo)內(nèi)源性GEP的表達(dá)，無(wú)論在轉(zhuǎn)錄水平還是蛋白水平都增

5、加。 3．通過(guò)對(duì)GEP基因核酸序列的分析，發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)有5個(gè)潛在的MyoD結(jié)合位點(diǎn)，我們使用了4個(gè)GEP特異性報(bào)告基因質(zhì)粒，含有不同數(shù)量的MyoD結(jié)合位點(diǎn)，共轉(zhuǎn)染上述報(bào)告基因與MyoD的真核表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)檢測(cè)熒光素酶表達(dá)活性研究MyoD對(duì)于GEP表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，MyoD可以激活GEP特異報(bào)告基因，MyoD在成肌細(xì)胞分化過(guò)程中具有調(diào)節(jié)GEP轉(zhuǎn)錄的功能。 4．應(yīng)用點(diǎn)突變技術(shù)，我們?cè)趫?bào)告基因271GEP-luc中GE

6、P的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)引入了MyoD結(jié)合位點(diǎn)的點(diǎn)突變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MyoD失去激活作用，同時(shí)應(yīng)用凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn)及染色質(zhì)免疫共沉淀，證明在成肌細(xì)胞分化過(guò)程中MyoD對(duì)GEP基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用通過(guò)MyoD直接結(jié)合到GEP基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的MyoD結(jié)合位點(diǎn)上實(shí)現(xiàn)。 5．我們研究了GEP過(guò)表達(dá)與低水平對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響。結(jié)果顯示，在成肌細(xì)胞分化過(guò)程中，高水平GEP能夠抑制成肌細(xì)胞的分化，而在低GEP的細(xì)胞環(huán)境中，分化被促進(jìn)了。 6．為了揭

7、示GEP抑制骨骼肌分化的分子機(jī)制，我們進(jìn)一步研究了GEP在肌分化過(guò)程中，對(duì)成肌因子家族的作用。實(shí)驗(yàn)證明GEP在成肌細(xì)胞分化過(guò)程中抑制MyoD、Myf5、Myogenin、MHC基因的表達(dá)。 7．JunB可以抑制骨骼肌分化。我們?cè)诩》只脑缙冢瑧?yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR，免疫印跡和細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)GEP對(duì)JunB表達(dá)的調(diào)控，發(fā)現(xiàn)GEP誘導(dǎo)JunB的表達(dá)。成功構(gòu)建JunB表達(dá)質(zhì)粒及JunB siRNA質(zhì)粒，通過(guò)檢測(cè)熒光素酶表達(dá)活性及MH