Draxin在小鼠脊髓損傷修復(fù)過程中的表達變化及其表達位置的實驗研究.pdf

1、目的:成功建立脊髓背側(cè)半橫切模型，觀察軸突生長導(dǎo)向因子draxin在脊髓損傷不同時期的表達變化及其在損傷脊髓中的表達位置，為其在臨床脊髓損傷疾病中的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1.動物及分組:2月齡體重約35g小鼠100只，按背側(cè)脊髓半橫切方式建立脊髓損傷模型，根據(jù)Reuter感覺功能評價方法，確定脊髓損傷背側(cè)半橫切模型建立成功。脊髓損傷模型隨機分為正常未損傷組、損傷1天組、損傷2天組、損傷3天組、損傷4天組、損傷5

2、天組、損傷6天組和損傷7天組，各10只，分別用于RT-PCR和Western Blot檢測。其余損傷小鼠模型分成損傷1天組、損傷2天組、損傷3天組、損傷5天組，各5只，用于損傷后脊髓組織免疫組織化學(xué)抗draxin抗體染色觀察，或用于免疫組織化學(xué)抗draxin抗體、抗DCC抗體雙染觀察。
　　2.mRNA提取及RT-PCR:正常未損傷組、損傷1天組、損傷2天組、損傷3天組、損傷4天組、損傷5天組、損傷6天組和損傷7天組每組各取5只，

3、10％水合氯醛麻醉后冰上迅速取下?lián)p傷節(jié)段脊髓，去除椎骨，暴露脊髓組織，DEPC水配制的PBS清洗后，將組織迅速轉(zhuǎn)移至Trizol中，常規(guī)提取mRNA，用NanoDrop2000C進行定量，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20℃保存，用于PCR。
　　3.蛋白提取及Western Blot:正常未損傷組、損傷1天組、損傷2天組、損傷3天組、損傷4天組、損傷5天組、損傷6天組和損傷7天組每組各取5只，10％水合氯醛麻醉后冰上迅速取下?lián)p傷節(jié)段脊髓，

4、去除椎骨，暴露脊髓組織，普通PBS清洗后迅速轉(zhuǎn)移至裂解液中，充分勻漿后于冰上靜置30min，12000rpm，4℃離心20min，取上清棄沉淀，小部分上清液用考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)濃度，其余部分上清液置于-80℃冰箱儲存，用于Western Blot檢測。
　　4.組織制備及免疫組織化學(xué)染色觀察:損傷1天組、損傷2天組、損傷3天組、損傷5天組，每組各取5只。將小鼠麻醉并暴露心臟，將輸液針刺入左心室，同時用剪刀挑開右心耳，迅速生理鹽

5、水沖洗，至無血后，用4％多聚甲醛進行灌注。取損傷節(jié)段脊髓組織，PBS清洗干凈，冷4％多聚甲醛固定2h，放入含30％蔗糖的PBS中充分沉降，取出組織OCT包埋，-80℃保存，用于免疫組織化學(xué)染色。
　　結(jié)果:
　　1.成年期小鼠脊髓損傷后不同時期draxin mRNA的表達變化成年期小鼠draxin mRNA在無損傷正常脊髓、損傷后1天、損傷后2天、損傷后3天、損傷后4天、損傷后5天、損傷后6天、損傷后7天的脊髓組織中均有表達

6、。隨著時間的推移逐漸增高，損傷后第3天出現(xiàn)了一個表達高峰，后又表達下降。IOD數(shù)值在不同的檢測時段有顯著的差異(P＜0.05)，組間兩兩比較，損傷后3天與其他組有顯著的差異(P＜0.05)，有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　2.成年期小鼠脊髓損傷后不同時期draxin蛋白的表達變化成年期小鼠draxin蛋白在無損傷正常脊髓、損傷后1天、損傷后2天、損傷后3天、損傷后4天、損傷后5天、損傷后6天、損傷后7天的脊髓組織中均有表達。隨著時間的推移dr

7、axin蛋白的表達逐漸增高，并在損傷后第3-5天出現(xiàn)了一個表達高峰，后其表達又有所下降。IOD數(shù)值在不同的檢測時段有顯著的差異（P＜0.05），組間兩兩比較，損傷后3-5天與其他組有顯著的差異(P＜0.05)，有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3.Draxin蛋白在成年期小鼠損傷脊髓中的表達位置及其變化Draxin陽性區(qū)域，熒光染色呈紅色。Draxin紅色信號集中于損傷切口的周邊。并且在損傷后1天、損傷后2天、損傷后3天、損傷后5天不同時間階段

8、，表達量呈損傷后1到5天逐漸增多趨勢，表達高峰集中于損傷后3-5天。
　　4.Draxin受體DCC在成年期小鼠損傷脊髓中的表達DCC為draxin受體之一。Draxin陽性區(qū)域，熒光染色呈紅色;DCC陽性區(qū)域，熒光染色呈綠色。Draxin紅色信號和DCC綠色信號表達位置都集中于切口周邊，且draxin蛋白與DCC蛋白表達位置一致，圖中呈暗黃色區(qū)域。
　　結(jié)論:
　　1.Draxin mRNA和draxin蛋白在成年期

9、小鼠正常脊髓組織中表達，表達含量微少，損傷后被誘導(dǎo)增多。
　　2.在成年期小鼠脊髓損傷的不同時間階段，draxin的表達量不同，脊髓損傷后1-7天的不同時間內(nèi)，出現(xiàn)了draxin mRNA和draxin蛋白損傷后3-5天的表達高峰。
　　3.Draxin蛋白在成年期小鼠損傷的脊髓中被誘導(dǎo)增多，且表達集中于損傷切口周邊，并且在損傷后1-5天的不同時間內(nèi)，呈現(xiàn)損傷后1天、損傷后2天、損傷后3天、損傷后5天表達量逐漸增多趨勢。