干擾RhoA表達(dá)修復(fù)脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：檢測(cè)大鼠脊髓損傷后不同時(shí)間RhoA的表達(dá)，探討其與神經(jīng)軸突再生、脊髓功能之間的相關(guān)性，并通過C3干擾RhoA的表達(dá)，探討其治療脊髓損傷的療效，為修復(fù)脊髓損傷提供新策略。 方法：1.在基因表達(dá)和蛋白質(zhì)翻譯雙重水平上，觀察脊髓損傷后不同時(shí)間RhoA的表達(dá)情況Wistar大鼠80只，隨機(jī)分為對(duì)照組(40只)，實(shí)驗(yàn)組(40只)以IMPACTOR-II法建立T10急性脊髓損傷模型，分別于造模成功后8小時(shí)、24小時(shí)、3天、7天和2周對(duì)

2、照組和實(shí)驗(yàn)組各取4只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，提取損傷段脊髓的總RNA，實(shí)時(shí)定量PCR和凝膠電泳檢測(cè)RhoAmRNA的表達(dá)：兩組另取4只動(dòng)物于上述時(shí)間段，行損傷段脊髓冰凍組織切片，免疫組化染色觀察RhoA蛋白表達(dá)情況。2.通過C3干擾RhoA表達(dá)，觀察對(duì)大鼠脊髓功能恢復(fù)情況的影響Wistar大鼠36只以IMPACTOR-II法建立T10急性脊髓損傷模型，造模成功后隨機(jī)分為3組，每組12只，分別為：對(duì)照組、脊髓損傷局部多點(diǎn)注射C3組(1.75mg/kg，

3、分3個(gè)點(diǎn)注射)和尾靜脈注射C3組(250μg/kg/天，造模后連用7天)。造模7天后每組各取4只動(dòng)物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)和組織切片免疫組化染色，測(cè)定RhoA活性；每周對(duì)各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)情況進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分(BBB評(píng)分法)；12周后進(jìn)行BDA(biotinylateddextranamine，生物素化葡聚糖胺)神經(jīng)順行示蹤標(biāo)記，標(biāo)記2周后取出實(shí)驗(yàn)動(dòng)物損傷段脊髓，行5μm快速冰凍切片，并進(jìn)行進(jìn)行熒光染色及HE染色。

4、 結(jié)果：脊髓損傷后8小時(shí)RhoAmRNA表達(dá)開始增高，傷后3天達(dá)高峰，7天后開始降低，2周時(shí)表達(dá)顯著降低，與對(duì)照組無顯著性差異；免疫組化染色顯示：RhoA蛋白于脊髓損傷后3天染色明顯增強(qiáng)，并持續(xù)高表達(dá)2周。脊髓損傷后7天實(shí)時(shí)定量PCR及組織切片免疫組化結(jié)果顯示：兩實(shí)驗(yàn)組(脊髓損傷局部多點(diǎn)注射C3組和尾靜脈注射C3組)RhoA表達(dá)較對(duì)照組降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而兩實(shí)驗(yàn)組之間無顯著性差異；BBB評(píng)分4周以后組間比較，差

5、異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中尾靜脈注射C3組明顯高于對(duì)照組(P<0.05)：12周后HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察顯示，應(yīng)用C3組，有部分神經(jīng)纖維通過損傷部位，而對(duì)照組幾乎未見再生神經(jīng)纖維穿越，兩組都可見脊髓空洞及膠質(zhì)瘢痕形成；12周BDA神經(jīng)示蹤顯示實(shí)驗(yàn)組軸突再生延伸明顯增加，皮質(zhì)脊髓束再生延伸，部分可以通過損傷區(qū)到達(dá)遠(yuǎn)端。 結(jié)論：大鼠脊髓損傷后RhoAmRNA表達(dá)明顯增高，且具有明顯時(shí)間曲線，RhoA蛋白表達(dá)增高較mRNA