自聚合肽納米纖維材料介導siRNA干擾RhoA表達促進小鼠脊髓損傷修復.pdf

1、本研究旨在為組織工程治療神經(jīng)損傷、疾病探索新的治療策略——自聚合納米纖維材料(self-assembling peptide nanofiber scaffold,SAPNS)介導RNA干擾(RNA interference,RNAi)RhoA表達促進脊髓損傷的修復。
　　 目前治療脊髓損傷的方法很多,外周神經(jīng)移植、細胞移植、生物材料填充損傷腔以及消除抑制因子等。這些研究在一定程度上都促進了脊髓損傷的修復。然而,外周神經(jīng)移植需要

2、考慮神經(jīng)來源、細胞移植也有其來源及倫理道德方面的局限、消除抑制因子不徹底、以及治療策略的單一性、難以針對脊髓損傷修復困難的諸多不利因素等,都成為脊髓損傷修復的瓶頸。
　　 因此,尋求新型生物材料和探索新的方法避免以上問題,從而為臨床運用提供更具可行性的策略,成為脊髓損傷修復的研究熱點。近年來,各種新方法和新型生物材料不斷涌現(xiàn)。
　　 SAPNS是近年來由美國麻省理工學院Zhang S課題組發(fā)明的一新型納米材料,目前已經(jīng)證

3、明它在多種組織修復中能發(fā)揮良好的效果,被認為是組織損傷修復中最具應用前景的組織工程修復材料之一。其在組織損傷修復的運用中相比其他生物材料具有以下優(yōu)勢:不會引起明顯的免疫排斥反應和炎癥反應、其納米纖維直徑非常接近細胞外基質,能為細胞存活與遷移提供三維環(huán)境,能將攜帶生物致病源和污染的風險降到最低,具有極好的組織相容性,無細胞毒性,降低產(chǎn)物可被組織吸收利用。
　　 研究表明RhoA在脊髓損傷修復中具有重要的作用。RhoA是屬于Rho家

4、族的一種小分子GTPase,它是所有真核細胞細胞骨架肌動蛋白的調(diào)節(jié)因子。RhoA在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育階段對神經(jīng)元遷移和突起的生長發(fā)揮重要作用,但在成年神經(jīng)元中基本不表達。當神經(jīng)元受損后8h,RhoA表達又開始增高,損傷后3d可達到高峰,并可持續(xù)高表達2w以上。RhoA在神經(jīng)元損傷后重新高表達是中樞神經(jīng)再生困難的一個重要因為。
　　 目前已知的抑制神經(jīng)再生的大部分相關因子都是通過激活下游的RhoA信號通路來發(fā)揮作用的。脊髓損傷后RhoA

5、表達的增高可導致軸突生長錐塌陷以及受損神經(jīng)元凋亡,這些都是導致脊髓損傷后再生困難的主要因為。因此,設法降低RhoA的表達或抑制其信號通路有可能成為促進脊髓損傷修復的一個新的治療策略。
　　 RNA干擾是近十幾年來迅速發(fā)展起來的一種新型分子生物學技術,它可利用 siRNA,-shRNA或miRNA感染靶細胞以降低特定基因的表達。目前,已有不少關于導入 siRNA進行體內(nèi)RNA干擾的報道。其中對中樞神經(jīng)組織進行RNA干擾的方法主要有

6、2種:即靜脈注射和局部微量注射。然而靜脈注射用藥量大難以避免全身副作用,局部微量注射可對神經(jīng)組織造成不必要的二次損傷。所以有必要探索更加確實可行的用藥方法。
　　 本研究在脊髓損傷模型的基礎上,在損傷處移植含有 RhoA特異性 siRNA(RhoA—siRNA)和 SAPNS的復合材料,針對脊髓修復難點的多種復雜因素,以期在修復脊髓損傷處的同時減低RhoA的表達,從而探索促進脊髓損傷后結構與功能修復的新方法。
　　 本研

7、究分三個部分。
　　 第一部分:移植材料構建以及脊髓損傷模型建立和移植。
　　 昆明小鼠,雌性,65只,12周齡,30-35g;動物分組和每組數(shù):假手術組(sham)10只,生理鹽水組(saline)15只,SAPNS組17只,siRNA+SAPNS組23只。
　　 無菌下取0.50DRhoA特異性干擾 RNA(RhoA-siRNA)或熒光標記 siRNA(FAM-siRNA),用6μl DEPC水溶解。取2μl

8、siRNA溶液,2μlLipofect2000以及10μlSAPNS,于干凈的培養(yǎng)皿中迅速混合,后置于0.1M PBS溶液中4℃下孵育30min,使材料充分聚合。昆明小鼠麻醉后在小鼠 T7-9位置打開椎板,暴露脊髓,剪開硬脊膜后在T8位置垂直切除長度為1mm的一段脊髓。在形成的損傷腔內(nèi)填充上述構建的移植材料或等量的生理鹽水。
　　 第二部分:siRNA轉染效率和RhoA表達的檢測。
　　 siRNA轉染效率檢測:移植入

9、FAM-siRNA+SAPNS的小鼠在手術后2d,1w,2w取材,取材部位脊懿為 T6-11,腦為皮質運動區(qū)。后做冰凍切片,在熒光顯微鏡下觀察并拍照,記錄siRNA進入脊髓和大腦皮質運動區(qū)神經(jīng)元的情況。結果顯示,siRNA被脊髓神經(jīng)元軸突攝取,并且順利進入大腦運動皮質區(qū)神經(jīng)元胞體。
　　 RhoA表達的檢測:手術后1w各組任取5只小鼠,取材切片。行RhoA免疫組織化學染色,檢測RhoA表達。在熒光顯微鏡下觀察損傷區(qū)及其附近神經(jīng)元

10、內(nèi)RhoA表達情況,并拍照記錄。結果顯示,在RhoA-siRNA+SAPNS組中,RhoA表達顯著降低。
　　 第三部分:脊髓修復效果評定,行為學檢測和軸突再生定量分析。
　　 對實驗所得計量資料軸突密度數(shù)據(jù)使用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行方差分析(One-Way ANOVA)后用 LSD法作兩兩之間比較；BMS評分值用非參數(shù)Kruskal-Wallis H檢驗法多組間比較,組間兩兩比較用 Mann-Whitney

11、U檢驗。
　　 后肢功能評定:手術后10w對所有剩下小鼠進行后肢運動功能BMS評定。軟件結果顯示,RhoA-siRNA+SAPNS組小鼠功能恢復好于損傷組,組間差異有統(tǒng)計學意義。
　　 軸突再生定量分析:術后10w取材切片,行軸突特異性標志蛋白NF200免疫組織化學染色,拍照,每只動物記錄5張切片,使用圖像分析系統(tǒng)(Image-ProPlus；Media Cybernetics,Silver Spring,Marylan