纖維蛋白支架用于移植修復脊髓損傷的實驗研究.pdf

1、目的：探討纖維蛋白支架對神經(jīng)干細胞和星形膠質(zhì)細胞分化及增殖的影響；評價纖維蛋白支架在神經(jīng)組織內(nèi)的生物相容性，觀察支架在體內(nèi)的改建過程。為纖維蛋白用于構(gòu)建組織工程支架移植修復脊髓損傷提供可行性研究資料。 方法：1．用培養(yǎng)基將纖維蛋白原制成膠狀溶液，在新鮮鼠血漿中凝血酶的促凝作用下，使其凝固成多孔的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的纖維蛋白支架。顯微鏡觀察支架的表面結(jié)構(gòu)，并用電子顯微鏡觀察支架內(nèi)部的三維結(jié)構(gòu)。 2．分別培養(yǎng)胚胎大鼠脊髓來源的

2、神經(jīng)干細胞和新生鼠脊髓神經(jīng)膠質(zhì)細胞，接種于纖維蛋白支架上，同時用多聚賴氨酸修飾的玻片作為對照。于體外培養(yǎng)不同時間(3天、7天、14天)后，用神經(jīng)絲蛋白(NF200)對神經(jīng)細胞進行免疫熒光染色，測量各復孔(n=4)內(nèi)NF陽性細胞的突起長度，計算其平均值；培養(yǎng)14天后，用膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)對膠質(zhì)細胞進行染色，各復孔(n=4)內(nèi)統(tǒng)計5個不同視野的膠質(zhì)細胞總數(shù)和GFAP陽性細胞數(shù)，計算GFAP陽性細胞相對數(shù)量的平均值。用免疫印跡技術(shù)對

3、熒光染色結(jié)果進行驗證。比較在纖維蛋白支架和玻片上神經(jīng)干細胞分化、神經(jīng)纖維延伸及神經(jīng)膠質(zhì)細胞增殖的差異，分析支架對神經(jīng)干細胞和星形膠質(zhì)細胞分化及增殖影響。 3．將纖維蛋白支架植入大鼠脊髓完全橫斷缺損部位，同時以脊髓完全橫斷缺損大鼠作為對照組。動物存活不同時間后，取出支架植入部位的組織，應(yīng)用透射電鏡觀察支架移植部位的組織學結(jié)構(gòu)及支架在神經(jīng)組織內(nèi)的降解和改建過程，評價支架的組織相容性。 4．將纖維蛋白支架植入大鼠脊髓完全橫斷缺

4、損部位，同時以脊髓完全橫斷缺損大鼠作為對照組。動物存活不同時間后，取出支架/脊髓組織，用免疫熒光雙標和免疫印跡技術(shù)分析損傷部位/支架移植區(qū)的神經(jīng)纖維再生和膠質(zhì)纖維增生情況。評價纖維蛋白支架移植對大鼠脊髓損傷后神經(jīng)再生及膠質(zhì)瘢痕形成的影響。 5．將纖維蛋白支架植入大鼠脊髓完全橫斷缺損部位，同時以脊髓完全橫斷缺損大鼠作為對照組。分別于術(shù)后4周，8周，12周對各組動物下肢運動功能進行BBB評分。比較各組動物后肢運動功能的恢復程度。評價

5、支架移植用于修復脊髓損傷的效果和臨床應(yīng)用的可行性。 結(jié)果：1．纖維蛋白支架呈半透明多孔海綿狀，質(zhì)地柔軟有彈性。支架縱切面經(jīng)伊紅染色后用光鏡觀察，支架內(nèi)部呈多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。用掃描及透射電鏡觀察支架內(nèi)部纖維蛋白纖維的縱、橫切面，具有三維多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 2．于體外培養(yǎng)的各觀察時間點，纖維蛋白支架組的NF陽性纖維明顯長于對照組(3天和7天組，P＜0.05；14天組，P＜0.01)；而各時間點的GFAP的表達水平明顯低于對照組(P

6、＜0.05)。體外培養(yǎng)14天后，支架組GFAP細胞陽性率為23.5％，對照組為69.1％，支架組的GFAP陽性星形膠質(zhì)細胞相對數(shù)量明顯少于對照組。 3．實驗組術(shù)后12周，仔細分離移植部位粘連的周圍組織取出整體脊髓，可見脊髓缺損部位移植支架后已完全愈合，局部組織增生，脊髓外觀飽滿完整；對照組術(shù)后12周，缺損部位有致密的瘢痕增生并與背側(cè)結(jié)締組織粘連，分離周圍組織，取出整體脊髓，可見缺損部位大部分已修復，局部有暗紅色塌陷區(qū)，整體脊髓外

7、觀欠飽滿。透射電鏡觀察實驗組脊髓支架移植部位和對照組脊髓缺損瘢痕修復部位的超微結(jié)構(gòu)，可見實驗組支架內(nèi)有毛細血管和有髓神經(jīng)纖維分布；對照組局部組織內(nèi)存在空洞，空洞內(nèi)有組織碎片和漿細胞，洞壁細胞排列緊密。 4．術(shù)后4～12周，支架移植組可見支架內(nèi)有少量神經(jīng)纖維，此后神經(jīng)纖維逐漸增多，而膠質(zhì)細胞增生不明顯；對照組脊髓損傷局部可見壞死空洞，空洞周邊膠質(zhì)細胞增生明顯。免疫印跡檢測結(jié)果顯示：術(shù)后各時間點，支架移植組神經(jīng)絲蛋白(NF200)相

8、對含量高于對照組；對照組膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的相對含量高于支架移植組。結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學處理，均具有顯著性差異(P＜0.05)。 5．術(shù)后兩組動物的運動功能均有不同程度的恢復，但對照組動物恢復較慢。各觀察時間點BBB評分，支架移植組均高于對照組，統(tǒng)計學有顯著性差異(P＜0.05)。 結(jié)論：1．纖維蛋白支架外觀半透明具有較好的韌性，可促進神經(jīng)干細胞向神經(jīng)細胞分化并有利于神經(jīng)纖維的延伸而抑制星形膠質(zhì)細胞的增殖成熟。